董文江,胡榮鎖,宗 迎,龍宇宙,趙建平
(1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所,海南萬寧571533;2國家重要熱帶作物工程技術(shù)研究中心,海南萬寧571533;3海南省熱帶香料飲料作物工程技術(shù)研究中心,海南萬寧571533)
咖啡原產(chǎn)于埃塞俄比亞,與可可、茶葉并稱世界三大飲料,其產(chǎn)量、產(chǎn)值和消費(fèi)量均居三大飲料作物之首,在國際貿(mào)易中是僅次于石油的第二大原料型產(chǎn)品,香氣被認(rèn)為是咖啡最重要的屬性之一[1-2]。在咖啡植物品種中‘阿拉比卡’(即小粒種咖啡)已被報(bào)道為最具芳香氣味的品種,它通常用于生產(chǎn)卓越品質(zhì)的沖泡咖啡。中國咖啡的主產(chǎn)區(qū)位于海南和云南地區(qū),其中98%的咖啡出自云南[3]。云南熱區(qū)的自然條件與世界上質(zhì)量最好的咖啡產(chǎn)地——哥倫比亞十分相似,即低緯度、高海拔、晝夜溫差大。云南種植的主要是小??Х?,具有濃而不苦、香而不烈、略帶果酸味的特點(diǎn),可與世界上最好的藍(lán)山咖啡媲美,曾被國際咖啡組織(International coffee organization,ICO)評為一類產(chǎn)品[4-6]。
生咖啡豆中的化學(xué)組分由于烘焙發(fā)生一系列反應(yīng)(如美拉德和焦糖化反應(yīng)等)才能形成咖啡特有的風(fēng)味,而生咖啡豆中揮發(fā)性成分較少。目前,國外科學(xué)工作者已經(jīng)鑒定出生咖啡豆中絕大部分的揮發(fā)性物質(zhì),并對咖啡的特征香氣物質(zhì)進(jìn)行了研究。Toci等[7]采用HS-SPME/GC-MS對巴西生咖啡豆中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析,共鑒定出43種揮發(fā)性物質(zhì);Franca等[8-10]研究了生咖啡豆中風(fēng)味前體物質(zhì)(葫蘆巴堿、綠原酸、咖啡因、蔗糖、蛋白質(zhì)等)的含量與咖啡風(fēng)味品質(zhì)之間的關(guān)系。近年來,國內(nèi)對小??Х鹊难芯慷酁閺?fù)合栽培、病蟲害防控以及烘焙特性方面,對于云南主產(chǎn)區(qū)生咖啡豆的揮發(fā)性成分研究未見報(bào)道。張豐等[11]對云南不同地區(qū)3個(gè)烘焙度的烘焙豆揮發(fā)性成分進(jìn)行了研究,檢測出65種揮發(fā)性成分,其中呋喃類物質(zhì)相對含量最高,PCA和HCA可用來區(qū)分不同地區(qū)烘焙咖啡,酸類物質(zhì)可作為區(qū)分普洱同保山、臨滄地區(qū)樣品的判別指標(biāo),吡嗪類、呋喃類和酮類與臨滄地區(qū)樣品相關(guān)性較高,與保山地區(qū)樣品相關(guān)性較高物質(zhì)主要為吡啶類。烘焙豆與生豆的揮發(fā)性成分有差異,生豆中的揮發(fā)性成分通過烘焙過程中的美拉德反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)等會(huì)轉(zhuǎn)化為烘焙豆的芳香物質(zhì),筆者在其研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步補(bǔ)充完善。同一品種的‘阿拉比卡’樣品在不同產(chǎn)區(qū)的品質(zhì)差異顯著,由于咖啡種植具有較強(qiáng)的地域性,種植模式、氣候條件、海拔高度對咖啡香氣影響較大[12]。
咖啡為中國云南地區(qū)的高原優(yōu)勢特色資源,不同主產(chǎn)區(qū)特殊的地理環(huán)境導(dǎo)致其風(fēng)味成分不同,進(jìn)而影響產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值,因此有必要對不同地區(qū)生咖啡豆樣品中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。筆者以云南保山(BS)、德宏(DH)、臨滄(LC)和普洱(PE)4個(gè)主產(chǎn)區(qū)生咖啡豆為試材,采用HS-SPME/GC-MS對揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,利用系統(tǒng)聚類分析和主成分分析統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對樣品進(jìn)行區(qū)分,尋找對不同地區(qū)生咖啡豆品質(zhì)影響較大的特征化合物,旨在為云南地區(qū)咖啡豆的風(fēng)味品質(zhì)提升及產(chǎn)地追溯提供理論參考。
1.1.1 材料 生咖啡豆來源于云南省4個(gè)咖啡主產(chǎn)區(qū),包括保山咖啡(云南保山佐園咖啡莊園,BS,編號(hào):1~3號(hào))、德宏咖啡(云南德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,DH,編號(hào):4~6號(hào))、臨滄咖啡(云南臨滄凌豐咖啡產(chǎn)業(yè)有限公司鎮(zhèn)康分公司,LC,編號(hào):7~9號(hào))、普洱咖啡(云南普洱曼老江農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,PE,編號(hào):10~12號(hào))。濕法加工處理得到生咖啡豆。C7~C30正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.5%;美國Sigma公司)
1.1.2 儀器 VTA6S3型咖啡粉碎機(jī),德國MAHLKONIG儀器公司;Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國安捷倫公司;固相微萃取裝置和萃取頭(75 μm CAR/PDMS),美國Supelco公司
1.2.1 HS-SPME萃取法 固相微萃取頭插入在氣相色譜儀進(jìn)樣口老化,溫度為300℃,老化時(shí)間為1 h,備用;精確稱量1.5 g生咖啡豆粉末樣品(過40目篩)于20 mL采樣瓶中,加蓋密封,置于恒溫水浴鍋中預(yù)熱20 min。將萃取頭插入采樣瓶中吸附30 min,取出,插入250℃的GC-MS進(jìn)樣口解吸3 min。
1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)測定[13]
(1)色譜條件。DB-WAX色譜柱(30 m×0.25 mm× 0.25 μm);載氣為氦氣,流速為1.0 mL/min,不分流進(jìn)樣,時(shí)間為3 min。程序升溫40℃保持2 min后以1.5℃/min升至130℃,之后以4℃/min升至200℃,保持5 min;檢測器溫度(EI)為230℃,進(jìn)樣口溫度為250℃。
(2)質(zhì)譜條件。電噴霧離子源,其中離子源溫度、接口溫度、電子能量和掃描范圍(m/z)分別為230℃、250℃、70 eV和35~350 amu。
1.2.3 生咖啡豆中揮發(fā)性物質(zhì)的定性和定量分析
(1)定性。采用GC-MS的NIST08譜庫,結(jié)合匹配度(>85%)以及參考文獻(xiàn)對生咖啡豆中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析。
(2)定量。根據(jù)總離子流圖檢索NIST08譜庫結(jié)合參考文獻(xiàn)分析咖啡生豆揮發(fā)性特征組成,應(yīng)用峰面積歸一化法計(jì)算組分相對百分含量。
1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
(1)主成分分析(principal component analysis,PCA)是將多個(gè)變量通過線性變換,利用數(shù)據(jù)降維,線性組合得到前幾個(gè)主要變量的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法。采用SPSS 20.0提供的主成分分析法,將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,做因子分析,得到主成分的方差貢獻(xiàn)表,選擇主成分個(gè)數(shù)(PC)[14]。求出不同變量相應(yīng)的主成分特征向量,特征向量和標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)乘積即變量的主成分負(fù)荷量,然后求出該樣品的主成分得分對樣品的特性進(jìn)行推斷和評價(jià)。
(2)系統(tǒng)聚類分析(hierarchical cluster analysis,HCA)是研究樣品分類常用的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法,用于評價(jià)不同類別樣品間的差異以及樣品間的聚類分布和親緣關(guān)系。在本研究中,原始數(shù)據(jù)先經(jīng)過歸一化后再輸入至系統(tǒng)平臺(tái)運(yùn)算,利用SPSS 20.0軟件提供的系統(tǒng)聚類法,計(jì)算出歐式距離,畫出樹狀圖,依此來判斷各地區(qū)樣品的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近,并與PCA的分類結(jié)果進(jìn)行對比。
利用上述的HS-SPME條件結(jié)合GC-MS對云南不同地區(qū)生咖啡豆揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析。通過與NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫對照,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,共鑒定出42種揮發(fā)性物質(zhì),主要為酸類、酮類、醇類、碳?xì)漕悺Ⅴヮ?、醛類等幾類化合物,該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15-18]。不同地區(qū)生咖啡豆揮發(fā)性成分的總離子流圖如圖1所示。從圖1可看出,德宏(DH)地區(qū)中峰的個(gè)數(shù)和強(qiáng)度都要大于其他3個(gè)地區(qū),其次是保山(BS)地區(qū),臨滄(LC)和普洱(PE)地區(qū)中峰的個(gè)數(shù)較少,即揮發(fā)性成分相對較少。
圖1 云南不同地區(qū)生咖啡豆的GC-MS總離子流圖
對各成分進(jìn)行定性定量分析,利用GC-MS自帶的NIST08譜圖庫檢索,共鑒定出42種揮發(fā)性成分,采用峰面積百分歸一化法對各成分進(jìn)行定量分析。色譜峰對應(yīng)的揮發(fā)性物質(zhì)及各類化合物含量對比如表1和圖2所示。表中結(jié)果顯示,共分離鑒定出42種揮發(fā)性物質(zhì),其中酸類8種、酮類3種、醇類10種、碳?xì)漕?種、酯類5種、醛類2種、吡嗪類5種、含硫化合物4種、酚類2種以及吡啶類1種化合物。在保山(BS)、德宏(DH)、臨
滄(LC)和普洱(PE)4個(gè)地區(qū)的生咖啡豆中在檢測限范圍內(nèi)共匹配出7種共有揮發(fā)性成分,分別是3-甲基丁酸(28.11%)、乙醛(7.31%)、乙酸甲酯(2.08%)、2-羥基-2-甲基苯甲酸甲酯(5.31%)、丙醇(8.99%)、1-丁醇(0.91%)和苯甲醇(2.33%)。
表1 不同地區(qū)生咖啡豆的揮發(fā)性成分及其相對含量
從4個(gè)地區(qū)樣品中分別鑒定出22種、36種、13種和14種揮發(fā)性成分,其中,酸類物質(zhì)會(huì)影響咖啡風(fēng)味口感,德宏地區(qū)種類最多且含量也最高,臨滄和普洱地區(qū)含量接近,都非常少[19],在不同地區(qū)的相對含量排序是PE>BS>DH>LC,普洱地區(qū)咖啡中酸類物質(zhì)含量高達(dá)54.581%;酮類物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生青草香氣,其相對含量排序是LC>BS>PE>DH,臨滄地區(qū)咖啡中酮類含量占總量一半,而德宏地區(qū)咖啡中未檢測出酮類物質(zhì);醇類物質(zhì)的相對含量都比較少,但是檢測出的種類較多,其中丙醇、1-丁醇和苯甲醇3種物質(zhì)為共有物質(zhì),丙醇含量較高;酯類物質(zhì)的相對含量排序是BS>LC>PE>DH;醛類物質(zhì)在烘焙后會(huì)大量產(chǎn)生,生豆中乙醛含量較多,德宏和普洱地區(qū)含量相似,保山地區(qū)最少;吡嗪類物質(zhì)是具有較強(qiáng)氣味的芳香類化合物,在烘焙后表現(xiàn)為烘烤味和泥土味[20],德宏地區(qū)含量最高,而普洱地區(qū)未檢測到;含硫化合物的含量雖然不多卻對咖啡風(fēng)味形成起重要作用,其中2-糠基硫醇具有烘烤味和肉湯味,在高溫下容易形成[21],德宏地區(qū)含量最高,其他地區(qū)含量相似;酚類物質(zhì)中的4-乙烯基愈創(chuàng)木酚具有丁香味和香辛料氣味,愈創(chuàng)木酚具有塑料味和煙熏味[22],兩者含量均較低,前者只在保山地區(qū)檢測得到,后者只在德宏地區(qū)檢測得到;吡啶類物質(zhì)只在德宏地區(qū)檢測得到且含量非常少,其在烘焙后會(huì)產(chǎn)生焦糊味和餅干風(fēng)味[23]。
續(xù)表1
圖2 不同地區(qū)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)含量對比圖
以12個(gè)樣本的10類揮發(fā)性物質(zhì)相對含量構(gòu)成12×10矩陣,采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)解出的主成分全部方差解析表2和主成分因子得分表3。從表2可以看出,當(dāng)提取主要因子達(dá)到2時(shí),方差貢獻(xiàn)率77.99%,前2個(gè)因子可反映大部分樣品原始信息。
表2 PCA的全部方差解析表
表3 PCA的特征向量和載荷表
從表2中可看出,PC1的方差貢獻(xiàn)率為48.247%,PC2的方差貢獻(xiàn)率為29.747%,且前2個(gè)PC的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為77.994%,表明前2個(gè)主成分可解釋原始數(shù)據(jù)的大部分信息,故選擇前2個(gè)PC用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。由表3可知,提取出10種主要成分,第一主成分[式(1)]主要反映吡嗪類、酸類、醛類和碳?xì)漕惖男畔?;第二主成分[式(2)]用于表示醇類和酚類物質(zhì)的原始信息。不同地區(qū)樣品與揮發(fā)性成分的相關(guān)性可根據(jù)載荷的相對位置來判斷,載荷為矢量,既有大小又有方向,距離樣品越近、在PC1和PC2方向上值越大,則與樣品的相關(guān)性越大。載荷用于解釋各變量與PC間的相關(guān)性大小見表3,PC1與吡嗪類和酸類物質(zhì)相關(guān)性最大,醛類和碳?xì)漕愇镔|(zhì)次之,而與含硫化合物、酮類、醇類和酯類物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)性;PC2與醇類和酚類物質(zhì)相關(guān)性最大,酸類和吡嗪類物質(zhì)次之,與酮類、碳?xì)漕悺Ⅴヮ惡秃蚧衔镓?fù)相關(guān)。綜合分析各成分作用大小,酸類、酮類、醇類和碳?xì)漕愂?個(gè)地區(qū)生咖啡豆的主要揮發(fā)性物質(zhì)。由表3~4可知,與保山地區(qū)相關(guān)性較高的有酮類和醛類,德宏地區(qū)的有醇類、酯類和酚類,臨滄地區(qū)的有酸類、吡嗪類和碳?xì)漕悾斩貐^(qū)的有吡啶類和含硫化合物。從而,可以用揮發(fā)性物質(zhì)作為區(qū)分4個(gè)地區(qū)生咖啡豆的參照。
表4 主成分因子分析
圖3是以第一主成分為縱坐標(biāo),第二主成分為橫坐標(biāo)獲得的生咖啡豆主成分二維散點(diǎn)圖,10種揮發(fā)性成分分為3類,第1類有酸類、醇類、酯類、酚類、吡嗪類和碳?xì)漕悾?類有吡啶類和含硫化合物,第3類有酮類和醛類。2個(gè)主成分即可反映生咖啡豆揮發(fā)性物質(zhì)的基本特征。圖4是以前2個(gè)主成分為x軸和y軸獲得的不同地區(qū)主成分分析二維散點(diǎn)圖,每個(gè)地區(qū)的樣品各自聚為一類,其中德宏地區(qū)樣品位于第一象限,保山地區(qū)樣品位于第二象限,普洱地區(qū)樣品位于第三象限,臨滄地區(qū)樣品位于第四象限,4個(gè)地區(qū)的樣品分別位于不同象限,各自聚為一類,說明主成分分析能夠反映不同地區(qū)生咖啡豆的基本特性。
圖3 生咖啡豆的PCA二維載荷投影圖
圖4 生咖啡豆的PCA二維得分投影圖
將表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,利用SPSS 20.0軟件對標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建4個(gè)地區(qū)樣品間的親緣關(guān)系樹狀圖,圖5是以揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)據(jù)矩陣(12個(gè)樣品×10個(gè)變量)為輸入變量的聚類分析樹狀圖。
從圖5中可看出,BS、DH、LC、PE 4個(gè)地區(qū)樣品間歐式距離較短,BS和LC地區(qū)樣品距離最近,PE和DH地區(qū)樣品距離較近,DH和LC地區(qū)樣品距離較遠(yuǎn),PE和LC地區(qū)樣品距離最遠(yuǎn),但每個(gè)地區(qū)之間親緣關(guān)系不是很近,按各自特性分別聚為一類,當(dāng)歐式距離為1.0時(shí)即可將4個(gè)地區(qū)樣品完全區(qū)分開,這與PCA分析結(jié)果一致,表明可用此方法鑒別不同地區(qū)的生咖啡豆。
(1)采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(HSSPME/GC-MS)技術(shù)對云南4個(gè)地區(qū)(保山、德宏、臨滄和普洱)生咖啡豆的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析,共分離鑒定出45種香氣物質(zhì),4個(gè)地區(qū)依次鑒定出23種、37種、13種和14種揮發(fā)性成分,其中呋喃類7種、酮類3種、醇類9種、碳?xì)漕?種、酯類5種、醛類2種、吡嗪類5種、酸類5種、含硫化合物4種、酚類2種、吡啶類1種。其中保山地區(qū)的醇類和酯類相對含量較高,德宏地區(qū)的碳?xì)漕悺⑺犷?、吡嗪類和含硫化合物相對含量較高,臨滄地區(qū)的酮類和醛類相對含量較高,普洱地區(qū)的呋喃類相對含量較高。4個(gè)地區(qū)共有成分有7種,分別為3-甲基丁酸、乙醛、乙酸甲酯、2-羥基-2-甲基苯甲酸甲酯、丙醇、1-丁醇和苯甲醇,占總揮發(fā)性物質(zhì)的54.86%。
圖5 以揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)據(jù)矩陣為輸入變量的聚類分析樹狀圖
(2)PCA的第一主成分貢獻(xiàn)率為48.247%,第二主成分貢獻(xiàn)率為29.747%,前2個(gè)主成分可以反映不同地區(qū)生咖啡豆的主要揮發(fā)性物質(zhì),還可以利用揮發(fā)性物質(zhì)區(qū)分不同地區(qū)的生咖啡豆。酮類和醛類物質(zhì)可作為區(qū)分保山和其他3個(gè)地區(qū)的判斷指標(biāo),醇類、酯類和酚類物質(zhì)可作為區(qū)分德宏和其他3個(gè)地區(qū)的判斷指標(biāo),酸類、吡嗪類和碳?xì)漕愇镔|(zhì)與臨滄地區(qū)樣品相關(guān)性較高,吡啶類和含硫化合物與臨滄地區(qū)樣品相關(guān)性較高。
(3)HCA的樹狀圖顯示4個(gè)地區(qū)生咖啡豆可以各自聚為一類,4個(gè)地區(qū)的親緣距離都較遠(yuǎn),這與PCA的分析結(jié)果一致。通過對云南不同地區(qū)生咖啡豆的揮發(fā)性物質(zhì)分析,建立揮發(fā)性物質(zhì)和地區(qū)的相關(guān)性,根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)的差異為判斷指標(biāo)可以很好地區(qū)分云南不同地區(qū)咖啡豆,為云南咖啡的風(fēng)味品質(zhì)提升及產(chǎn)地追溯提供理論依據(jù)。
生咖啡豆中揮發(fā)性成分對于烘焙咖啡產(chǎn)品的香氣形成至關(guān)重要,它們既包括咖啡生長過程中形成的成分,亦受采后加工過程中如脫膠、干燥及貯藏等過程影響。揮發(fā)性成分已被廣泛用于咖啡豆的地理來源鑒別、品質(zhì)好壞區(qū)分以及脫膠過程中微生物對咖啡質(zhì)量調(diào)控等方面,國內(nèi)外對于云南不同產(chǎn)區(qū)生咖啡豆中揮發(fā)性成分的研究還未見報(bào)道。張豐等[11]通過HSSMPE/GC-MS對云南3個(gè)地區(qū)(普洱、保山、臨滄)烘焙豆中揮發(fā)性物質(zhì)分析,結(jié)果表明,呋喃類物質(zhì)含量最高,不同地區(qū)樣品可區(qū)分開。董文江等[24]對云南不同地區(qū)生咖啡豆風(fēng)味前體物質(zhì)研究表明,普洱咖啡中脂肪酸和其他地區(qū)均呈顯著性差異(P<0.05);保山咖啡中氨基酸同其他地區(qū)均呈顯著性差異;而臨滄咖啡中單糖、蛋白質(zhì)、脂肪和保山咖啡均呈顯著性差異。Bertrand等[15]考察了氣候和地理環(huán)境因素對留尼旺島阿拉比卡生豆中揮發(fā)性成分和咖啡液質(zhì)量的影響,酸度、果香和風(fēng)味與低氣溫環(huán)境密切相關(guān),而高氣溫環(huán)境增加醇類物質(zhì)的積累,海拔高度和平均氣溫對咖啡質(zhì)量影響顯著。本研究中通過化學(xué)計(jì)量學(xué)方法結(jié)合HSSPME/GC-MS可推測中生咖啡豆中與各地區(qū)相關(guān)性較大的成分。
Lee等[25]通過微生物調(diào)控生咖啡豆脫膠過程中發(fā)酵過程,改變生豆中揮發(fā)性成分及其他反應(yīng)前體物如脯氨酸和天冬氨酸含量增加1.5倍,阿魏酸和咖啡酸的大量降解導(dǎo)致?lián)]發(fā)性風(fēng)味化合物濃度增加2倍以上。Saw等[26]研究東南亞地區(qū)阿拉比卡、利比里亞和羅布斯塔生豆中揮發(fā)性成分,3類樣品中揮發(fā)性成分組成極為相似,均具有較高含量的酚類物質(zhì),主要為p-乙烯基愈創(chuàng)木酚和羧酸,同時(shí)評價(jià)其抗氧化特性。因此,生豆中揮發(fā)性成分對咖啡最終產(chǎn)品的質(zhì)量至關(guān)重要,后續(xù)研究可進(jìn)一步通過相關(guān)性分析建立云南小粒種生咖啡豆中揮發(fā)性成分與烘焙豆杯測得分、電子感官得分及物化指標(biāo)間的相關(guān)性模型,更加客觀真實(shí)地評價(jià)特定產(chǎn)區(qū)原料對最終產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)的影響,對于云南地區(qū)咖啡豆質(zhì)量提升和產(chǎn)地追溯具有指導(dǎo)意義。