丁萬軍 黃莉 曾濤 戈偉 張煜坤 郭衛(wèi)春 余鈴

[摘要] 目的 檢測磷脂酰肌醇3激酶（PIK3CA）及谷胱甘肽-S-轉移酶π（GST-π）在骨肉瘤組織中的表達，探討其對骨肉瘤多藥耐藥的影響。 方法 收集武漢大學人民醫(yī)院2009年1月～2017年6月33例骨肉瘤病理組織標本，應用免疫組化方法（Envision法）及Western blot法測定PIK3CA、GST-π在骨肉瘤標本中的表達。比較化療耐藥組（7例）和化療有效組（26例）中表達的差異，并結合臨床病理因素進行分析。 結果 免疫組化檢測化療耐藥組和化療有效組的PIK3CA表達的平均吸光度值分別為（11.089±2.147）、（6.938±2.065），差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；化療耐藥組和化療有效組GST-π表達的平均吸光度值分別為（15.871±2.678）、（7.693±2.443），差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。Western blot法檢測兩組中PIK3CA和GST-π的蛋白表達，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。PIK3CA和GST-π在骨肉瘤組織中的蛋白表達具有相關性（r = 0.68，P < 0.01）。 結論 PIK3CA及GST-π在骨肉瘤化療耐藥組中高表達，且兩者表達呈正相關，其可能是骨肉瘤耐藥的發(fā)生機制之一。

[關鍵詞] 骨肉瘤；磷脂酰肌醇3激酶；谷胱甘肽轉移酶；多藥耐藥

[中圖分類號] R73 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（a）-0021-04

[Abstract] Objective To detect the expression of phosphatidylinositol 3-kinase （PIK3CA） and glutathione-S transferase-π （GST-π） in osteosarcoma tissues and to explore its effect on the multidrug resistance of osteosarcoma. Methods Thirty-three cases of pathological tissue specimens of osteosarcoma from Renmin Hospital of Wuhan University from January 2009 to June 2017 were collected. The expression of PIK3CA and GST-π of 33 cases of osteosarcoma specimens was detected by immunohistochemistry （Envision method） and Western blot method. The differences between the chemotherapy-resistant group （7 cases） and the chemotherapy-effective group （26 cases） were compared. The results were analyzed combined with clinicopathological factors. Results The average optical density of PIK3CA in the chemotherapy-resistant group and chemotherapy-effective group was （11.089±2.147） and （6.938±2.065） respectively， and there was a significant difference between the two groups （P < 0.05）； the average optical density of GST-π in the chemotherapy-resistant group and chemotherapy-effective group was （15.871±2.678） and （7.693±2.443）， and there was a significant difference between the two groups （P < 0.05）. The average optical density of PIK3CA and GST-π by Western blot method had significant differences between the two groups （P < 0.05）. The expression of PIK3CA and GST-π in osteosarcoma was correlated （r = 0.68， P < 0.01）. Conclusion PIK3CA and GST-π are over expressed in osteosarcoma chemotherapy-resistant group， and the expression of PIK3CA and GST-π is positively correlated with each other， which may be one of the mechanisms of drug resistance in osteosarcoma.

[Key words] Osteosarcoma； Phosphatidylinositol 3-kinase； Glutathione-S transferase； Multidrug resistance

骨肉瘤是最常見的骨惡性腫瘤之一，其發(fā)病部位以股骨遠端和脛骨近端最多見，發(fā)病年齡10～20歲占60%[1]。截肢術曾經(jīng)是骨肉瘤的標準治療術式，但術后患者5年生存率不足20%[2]。隨著腫瘤化療的發(fā)展，化療聯(lián)合保肢手術是新興的治療骨肉瘤的有效策略，可促使患者5年生存率提高近50%[3-4]。對于晚期患者，化療是其主要治療手段。然而有部分骨肉瘤患者因多藥耐藥（MDR）而對化療不敏感，導致治療失敗，這是影響骨肉瘤患者愈后的主要原因之一[5]。因此近年來，關于骨肉瘤化療耐藥的機制及尋找逆轉化療耐藥的新的靶點或藥物，是骨肉瘤相關研究的熱點和難點。細胞內(nèi)解毒系統(tǒng)增加化療藥物的外排是骨肉瘤化療耐藥的主要機制之一。谷胱甘肽-S-轉移酶π（glutathione-S-transferase-π，GST-π）是細胞內(nèi)解毒系統(tǒng)的關鍵組成部分，也是目前已經(jīng)證實的與MDR產(chǎn)生有密切關系的蛋白[6]。PI3K/AKT信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)并證實在人類多種腫瘤的發(fā)生、生長及浸潤過程中起了十分關鍵的作用的信號通路，其在多種腫瘤中激活，參與腫瘤細胞運動、抵抗凋亡等多個環(huán)節(jié)。PI3K/AKT信號轉導通路中的Ⅰ類磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinases，PI3Ks）的p110催化亞單位PI3Kp110α是該信號通路中的關鍵蛋白之一，其由PIK3CA基因編碼。因此，PIK3CA也是近年來研究的熱點基因。隨著人們對PIK3CA基因及蛋白（PIK3Kp110α）的深入研究，發(fā)現(xiàn)其在腫瘤的多藥耐藥中可能也起到重要作用[7]。在大腸癌中，PIK3CA高表達與其耐藥性相關。在骨肉瘤中，PIK3CA較正常組織高表達[8]，但其作用機制，特別是其與骨肉瘤化療耐藥的關系目前仍不明確。

本研究采用免疫組化Envision法和Western blot技術測定PIK3CA、GST-π在33例骨肉瘤組織中的表達，比較化療耐藥組和化療有效組中表達的差異，并結合臨床病理因素進行分析，旨在探討骨肉瘤PIK3CA及GST-π表達與骨肉瘤化療多藥耐藥的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取武漢大學人民醫(yī)院2009年1月～2017年6月有化療前明確組織學病理診斷及化療后療效評估的的骨肉瘤組織標本33例，其中男15例，女18例；年齡9～40歲，平均（18.7±4.6）歲；發(fā)病部位：股骨下端12例，脛骨上端9例，股骨上端4例，肱骨上端3例，股骨干3例，腓骨上端2例；Enneking分期：ⅡA期16例，ⅡB期6例，ⅢA期4例，Ⅳ期7例；8例為晚期姑息性化療，25例為術前新輔助化療，化療采用MAID方案，具體方案如下：美司那1500 mg/m2 CIV第1～4天，阿霉素20 mg/m2 CIV第1～3天，異環(huán)磷酰胺2500 mg/m2 CIV第1～3天，達卡巴嗪 300 mg/m2 CIV第1～3天，每21天重復。新輔助化療或姑息化療2個周期后按RECIST標準行療效評價。

1.2 化療療效評估和分組

該研究每位患者均有術前化療的影像學基礎評估，2個周期新輔助化療或姑息化療后，根據(jù)影像學變化（CT和/或MRI），選取目標病灶進行化療療效評價。化療療效評估標準采用歐洲腫瘤年會制訂的關于實體腫瘤的療效評價標準RECIST1.1版進行[9]。①完全緩解（CR）：所有目標病灶消失；②部分緩解（PR）：基線病灶長徑總和縮小>30%；③疾病進展（PD）：基線病灶長徑總和增加>20%或出現(xiàn)新病灶；④穩(wěn)定（SD）：基線病灶長徑總和有縮小但未達PR或有增加但未達PD[9]?；熡行О–R、PR及SD患者，化療耐藥指PD患者。據(jù)此療效評價標準將33例患者分為化療有效組（26例）和化療耐藥組（7例）。

1.3 試劑

兔抗人PI3Kinase p110α抗體濃縮液購自Cell Signaling Technology公司（工作濃度1∶100），鼠抗人GST-π單克隆抗體、通用型二抗以及其他輔助試劑均購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化檢測 嚴格按照Max VisionTM法染色程序進行免疫組化步驟操作：首先二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，然后用3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸高壓加熱進行抗原修復，加一抗后4℃過夜，PBS沖洗后滴加二抗，室溫孵育20 min，然后二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，脫水透明，中性樹膠封片。PIK3CA蛋白以已知陽性表達的腦組織作陽性對照，GST-π用已知陽性的乳腺癌為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。Carestream軟件顯微鏡采圖后，用Imagepro圖像分析軟件檢測平均吸光度值。

1.4.2 Western blot法檢測 從骨肉瘤組織中提取總蛋白，每孔道加入50 μg蛋白，進行SDS-PAGE電泳，電泳電壓100 V，共2～3 h電泳結束后進行PVDF膜轉膜，轉膜成功后置于5%脫脂奶粉封閉液中，37℃封閉2 h，然后用PBST洗膜后分別加入一抗PI3Kp110α和GST-π及β-actin，一抗按1∶10 000稀釋，4℃過夜。第2天用PBS洗膜后加通用型二抗，均按1∶5000稀釋，37℃孵育1 h，洗膜后ECL曝光，曝光后的膠片依次顯影、定影，室溫晾干、掃描，用Carestream軟件顯微鏡采圖后用Imagepro圖像分析軟件分析Western blot印跡結果中目的蛋白條帶和相應內(nèi)參條帶的凈吸光度值，以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值作為目的蛋白的相對灰度值。

1.4.3 免疫組化結果判定 PIK3CA、GST-π陽性表達在胞質(zhì)，以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標志，高倍鏡下計數(shù)5個視野或1000個細胞，陽性細胞數(shù)≥10%為陽性，否則為陰性。同時用Carestream軟件顯微鏡采圖后，用Imagepro圖像分析軟件檢測平均吸光度值。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，PIK3CA和GST-π表達的相互關系用Pearson相關分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Envision法檢測結果

化療有效組PIK3CA和GST-π的平均吸光度值明顯低于化療耐藥組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖1（封三）、表1。

2.2 Western blot法檢測結果

化療有效組PIK3CA和GST-π蛋白表達的平均吸光度值明顯低于化療耐藥組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖2、表2。

2.3 PIK3CA和GST-π的相關性分析

經(jīng)統(tǒng)計學分析，PIK3CA和GST-π在骨肉瘤組織中的表達呈正相關（r = 0.68，P < 0.01）。見表3。

3 討論

骨肉瘤是發(fā)病率最高的原發(fā)骨惡性腫瘤，過去的主要治療手段是采取截肢手術，然而術后患者容易發(fā)生復發(fā)轉移，導致預后極差。近年來隨著骨肉瘤化療的發(fā)展，患者的總體預后得到了極大的改善，化療聯(lián)合手術成了目前的標準治療模式。但有部分骨肉瘤患者存在MDR，這是導致腫瘤化療失敗的重要原因之一，并已經(jīng)成為影響這部分骨肉瘤患者預后的重要因素。根據(jù)Krishna等曾作出的分類標準可將MDR分為兩類——典型抗藥機制與非典型抗藥機制。典型機制中多藥耐藥相關蛋白及P-糖蛋白（P-gp）起主要抗藥作用，在非典型機制中谷胱甘肽S-轉移酶及拓撲異構酶等在多藥耐藥中起主要作用[10]。

GSTs是同源二聚體酶超基因家族的一種，有θ、μ、α、π等多種同工酶，其N端谷胱甘肽的結合位點含有酪氨酸殘基，其羥基可以與硫醇化谷胱甘肽形成氫鍵，在催化反應中有重要作用，C端為親電子結合區(qū)，為底物結合位點[11]。GST-π催化GSH的巰基能和多種體內(nèi)或者體外來源的親電化合物結合，結合后形成極性較大的復合物，這些復合物可以被多藥耐藥蛋白（MRP）和P-gp等泵出體外，從而實現(xiàn)GST-π的解毒作用。但同時，大多數(shù)化療藥物也可被GST-π催化和GSH結合形成GSH-藥物復合物，同樣易被MRP泵出體外，使抗腫瘤藥物在體內(nèi)作用時間變短，不能有效發(fā)揮作用，導致臨床上發(fā)生嚴重的腫瘤細胞MDR[11-12]。GST-π除了通過直接的細胞解毒，還可以抑制凋亡的MARK通路，抑制腫瘤細胞凋亡而導致耐藥[13]。本研究應用免疫組化法對骨肉瘤組織中GSTs的表達進行了測定，結果發(fā)現(xiàn)，在化療耐藥組中GSTs表達的吸光度值顯著高于化療有效組（P < 0.01）；同時采用Western blot方法檢測了兩組GSTs在骨肉瘤組織中的表達也得到同樣結果，以上結果提示GSTs的表達與骨肉瘤化療MDR有關，但GSTs表達的調(diào)節(jié)機制仍不明確。

PIK3CA基因定位于染色體3q26.3，長34 kb，其包含21個外顯子。PIK3CA基因編碼Ⅰ類磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinases，PI3Ks）的p110催化亞單位，即PI3Kp110a。PI3Kp110a具有類脂激酶和蛋白激酶的雙重活性，促使絲/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）活化，活化的AKT磷酸化多種底物參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡、分化以及遷移等有關的信號通路，因此PI3K/AKT通路在細胞信號轉導中發(fā)揮重要作用。PIK3CA的突變約4/5發(fā)生在螺旋區(qū)（exon9）和激酶區(qū)（exon20）這兩個熱點區(qū)域，其突變不僅可以減少細胞的凋亡，還可以促進腫瘤的浸潤，提高其下游激酶PI3Ks的活性，及導致PI3K/Akt信號通路的激活[14-16]。PI3K/Akt信號通路作為細胞生長、增殖和抗凋亡的重要調(diào)節(jié)因素，近年來研究表明其與腫瘤耐藥關系也十分密切[17-19]。張棟等[16]發(fā)現(xiàn)卵巢癌DDP耐藥機制與PI3K/Akt信號通路異常有關，并且證實通過抑制PI3K/AKT信號通路能增強卵巢癌對DDP的敏感性。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號傳導途徑的激活使得結腸癌細胞對5-Fu的耐藥性明顯增加。Gobin等[20]發(fā)現(xiàn)，PI3K由于其突變頻率高和/或其在癌細胞中的催化亞基功能增加，而成為骨肉瘤增殖轉移的關鍵機制。但目前有關PIK3CA與骨肉瘤耐藥關系研究極少，本研究以人骨肉瘤為研究對象，發(fā)現(xiàn)與化療有效組相比，化療耐藥組細胞的PIK3CA的陽性表達吸光度值明顯增高。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，PIK3CA與GSTs的表達具有相關性，提示PIK3CA可能通過調(diào)控GSTs的表達影響骨肉瘤的化療敏感性。

綜上所述，在化療耐藥組中PIK3CA及GST-π陽性表達率明顯高于化療有效組，提示PIK3CA及GST-π可能參與骨肉瘤多藥耐藥過程。同時PIK3CA與GST-π的表達呈正相關，提示PIK3CA可能是人骨肉瘤GST-π介導的多藥耐藥的關鍵機制之一。本研究的不足之處在于，未進一步驗證PIK3CA及GST-π對人骨肉瘤耐藥的調(diào)控及機制。

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