唐彥文，黃嘉興，杜亞彬，李想，王美枝，劉曉丹

摘要：本研究選取吉林市近郊稻草堆肥及長白山原始森林土樣，以稻草秸稈粉為唯一碳源進(jìn)行富集培養(yǎng)，利用愈創(chuàng)木酚為底物進(jìn)行初篩，最終篩選得到了1株降解特性較強(qiáng)菌株JNKJ5；進(jìn)一步經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列分析，該菌株初步鑒定為糙皮側(cè)耳（Pleurotusostreatus）。

關(guān)鍵詞：纖維素降解菌；篩選；菌株鑒定

基金項(xiàng)目：吉林省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院博士啟動基金；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院青年基金

中圖分類號： S816 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.18.020

我國是世界上最大的稻米生產(chǎn)國家，占全世界產(chǎn)量的35%，每年產(chǎn)生水稻秸稈約1.9×109t[1]。目前大量的水稻秸稈采用焚燒處理，這樣處理造成的危害極大，秋季霧霾的形成往往與焚燒秸稈有直接關(guān)系。稻草秸稈中豐富的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等組分使得水稻秸稈的自然降解率低[2]。目前，處理秸稈最實(shí)際且有效和經(jīng)濟(jì)的方法是微生物降解法[3]。而選擇具有高效降解特性的微生物菌株，是目前處理秸稈的關(guān)鍵問題。

經(jīng)過初篩獲得了高效降解菌株，在此基礎(chǔ)上，采用形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列分析相結(jié)合的方法對菌株可進(jìn)行鑒定。希望能為構(gòu)建工廠化稻草秸稈高效降解的工程菌株提供菌源和本研究以稻草秸稈為唯一碳源富集培養(yǎng)，進(jìn)一步以含0.1%愈創(chuàng)木酚的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，保證了篩選的高效性。技術(shù)支撐，對于促進(jìn)我國秸稈生物質(zhì)資源的充分利用、環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展貢獻(xiàn)力量。

1 試驗(yàn)方法

1.1稻草秸稈降解菌的篩選

采用以稻草秸稈粉為唯一碳源的固體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)[4]。按1∶10（質(zhì)量比）的接種量稱取兩種土樣，接種于富集培養(yǎng)基中，混勻，封口后，28℃恒溫培養(yǎng)15d，然后將其轉(zhuǎn)接在新鮮的培養(yǎng)基上，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次后進(jìn)行菌種分離。每個(gè)土樣做三個(gè)重復(fù)。

采用平板稀釋法對菌株進(jìn)行純化，將純化的菌株編號保藏。

將保藏的菌株活化后，使用打孔器獲得生長狀態(tài)一致菌塊，接種于0.1%愈創(chuàng)木酚的PDA培養(yǎng)基中[5]，28℃恒溫培養(yǎng)，定期觀察有色圈的形成情況。

1.2 稻草秸稈降解菌的鑒定

菌株的鑒定采用形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列分析相結(jié)合的方法[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻草秸稈降解菌的篩選

在富集培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，利用愈創(chuàng)木酚為底物篩選降解秸稈的菌株。最終共篩選到6株活性較強(qiáng)的菌株，命名為JNKJ1-6。其中，菌株JNKJ5產(chǎn)酶較早，接種24h后產(chǎn)生明顯紅棕色的有色圈，且最終形成的有色圈直徑大、顏色最深（見圖1）。

2.2 稻草秸稈降解菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征觀察 將篩選純化的菌株接種在PDA平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為28℃，定期觀察菌株的生長情況。菌株JNKJ5生長較快，3d可以大致覆蓋平板；菌落顏色由起初的白色變?yōu)樽罱K的淺灰色；菌落中間致密外周大較疏松，呈放射狀，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，菌絲茸毛裝，形似蜘蛛網(wǎng)，如圖2所示，初步判斷可能為白腐菌。

2.2.2 ITS序列分析 對已篩選出的纖維素降解菌株進(jìn)行rDNA ITS 序列擴(kuò)增，進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

ITS 序列的PCR擴(kuò)增選用引物ITS1和ITS4[6]，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3，擴(kuò)增獲得一條特異條帶，長度在500～750bp。將PCR產(chǎn)物送至測序公司進(jìn)行測序（見圖3）。

將測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST，通過相似性信息對比，可初步斷定菌株JNKJ5屬于Pleurotusostreatus，選擇與該菌株同屬不同種的幾種菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，該菌株與Pleurotusostreatus和Pleurotuseryngii在同一個(gè)分支上，親緣關(guān)系最近，屬于糙皮側(cè)耳。

3 結(jié)論

以稻草秸稈為唯一碳源，以吉林市近郊、原始森林腐殖土樣為樣本，利用愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基篩選獲得1株活性較高的菌株，命名為JNKJ5。通過菌落形態(tài)特征觀察和ITS序列分析初步鑒定分別為糙皮側(cè)耳。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國國家統(tǒng)計(jì)局.2009年中國國家統(tǒng)計(jì)年鑒[M].北京：中國統(tǒng)計(jì)出版社，2009.

[2]宋安東，張百良.雜色云芝產(chǎn)木質(zhì)纖維素酶及對稻草秸稈的降解過程[J].工程學(xué)報(bào)，2005（04）：414-419.

[3]蔡艷玲.水稻秸稈降解研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（02）：120-124，132.

[4]辛亞平，昝林森，杜雙田.降解纖維素菌株篩選及其鑒定[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2011（05）：1-5.

[5]王宜磊，朱陶，鄧振旭.愈創(chuàng)木酚法快速篩選漆酶產(chǎn)生菌[J].生物技術(shù)，2007，17（02）：40-42.

[6]高山，胡平，邊銀丙，張金霞.基于ITS序列對3個(gè)側(cè)耳菌種的分子鑒定[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，47（12）：1390-1393.

作者簡介：唐彥文，在讀本科生，研究方向：生物技術(shù)。

通訊作者：劉曉丹，博士，講師，研究方向：酶與蛋白質(zhì)工程的研究。