陳爾曼,鄧宗云,郭慧芝,黃復(fù)深,黃亞斌
(1.湖南省株洲市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,湖南 株洲 412000;2.珠江水產(chǎn)研究所,廣東 廣州 510145;3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖南 長沙 410128;4.湖南省醴陵市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局,湖南 醴陵 412200)
豬傳染性胸膜肺炎是由豬胸膜肺炎放線桿菌引起的一種高度傳染性疾病 。該病急性型死亡率可達(dá)100%,常表現(xiàn)為急性出血性纖維素性胸膜肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎。近些年來,隨著養(yǎng)豬集約化程度提高,豬群引種頻繁,導(dǎo)致該病的發(fā)病情況更加復(fù)雜,常呈混合感染,包括多種致病細(xì)菌、病毒性和寄生蟲病原在內(nèi)的混合感染,混合感染使該病及其它豬病的防制難度增大,經(jīng)濟(jì)損失巨大。
Pattison等1957年首次報道了該病。迄今為止,已證實(shí)本病世界范圍內(nèi)有廣泛流行,包括歐洲、美洲、非洲、澳洲、東南亞等地區(qū)。流行的主要血清型有血清1、2、5、7型,其中血清2型主要流行于歐洲國家,其他血清型主要在北美地區(qū)流行。1987年,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所首次確診豬傳染性胸膜肺炎臨床病例,證實(shí)了我國存在豬傳染性胸膜肺炎。目前我國二十多個省、市、自治區(qū)相繼分離出豬傳染性胸膜肺炎細(xì)菌,研究表明,我國流行的主要是血清 1、3、4、5、7型,主要以血清7型為主,其次為血清2、4、5、10型。
豬傳染性胸膜肺炎的防治以藥物為主,免疫預(yù)防主要采用滅活苗,但免疫保護(hù)譜窄,不能產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)。亞單位疫苗主要集中在其毒力因子,但其最大的缺點(diǎn)是免疫保護(hù)效果差,臨床應(yīng)用意義不大,因此有必要尋找新的疫苗候選分子。同時由于長期用藥抗藥性產(chǎn)生的可能性。因此篩選一些新的疫苗候選分子及藥物靶點(diǎn)非常重要,為此進(jìn)行了本研究。
1.1.1 菌種和培養(yǎng)基 豬胸膜肺炎放線桿菌血清1型來自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)從青島日水生物技術(shù)有限公司購買。無支原體超級新生牛血清從杭州四季青生物工程材料有限公司購買。NAD氧化型輔酶Ⅰ從北京鼎國生物技術(shù)有限公司購買。
1.1.2 主要試劑PCR反應(yīng)用試劑(2×Taq PCR Master Mix)、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(D2000 Maker)從北京天根生化科技有限公司購買。
1.2.1 豬胸膜肺炎放線桿菌ftsW基因的擴(kuò)增 根據(jù)Gen-Bank中已收錄的App基因組序列中的ftsW基因序列,應(yīng)用軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)ftsW外引物一對。PF 5'AAAGCGTATTGGTGGAGAC 3',PR 5'CGCCTGCCA TRACAAGAAGT 3'。引物送上海生物工程公司合成。
按文獻(xiàn)方法提取豬胸膜肺炎放線桿菌血清1型基因組DNA。以豬胸膜肺炎放線桿菌血清1型基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增App ftsW基因。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min,94℃變性50sec,55℃退火30sec,72℃延伸45sec,共30個循環(huán);最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測,確證后送上海生物工程公司測序。
1.2.2 ftsW的序列分析 序列的ORF(open reading frame,ORF)采用ORF finder分析??缒^(qū)采用TMHMM軟件,二級結(jié)構(gòu)采用SOPMA分析,功能區(qū)采用Pfam軟件進(jìn)行。在線應(yīng)用blast軟件找出豬胸膜肺炎放線桿菌不同血清型的FtsW蛋白相關(guān)的序列,用臨接法(NJ)繪制基因進(jìn)化樹分析,并用Megalign軟件對不同血清型的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行相似性分析。
以豬胸膜肺炎放線桿菌血清型3的基因組為模板,PCR擴(kuò)增目的基因ftsW。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳,可見一條大約1200bps左右的特異擴(kuò)增產(chǎn)物條帶,即獲得約1200bp的基因片段,與預(yù)期的結(jié)果一致(圖1)。ORF分析表明,該基因全長609bp,含一個完整開放閱讀框,起始密碼子為ATG,終止密子為TTT,編碼201個氨基酸。
圖 1 ftsW基因PCR擴(kuò)增電泳圖
應(yīng)用TMHMM軟件和SOPMA軟件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),該編碼蛋白為一跨膜蛋白,有6個跨膜區(qū)(圖2)。其二級結(jié)構(gòu)預(yù)測具有α-螺旋區(qū)、β-折疊區(qū)和無規(guī)卷曲4個二級結(jié)構(gòu)類型,其中α-螺旋區(qū)占二級結(jié)構(gòu)的76.2%,β-折疊占二級結(jié)構(gòu)的84.2%,無規(guī)卷曲占7.4%。HAMAP在線分析表明,該基因編碼的蛋白為肽聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶(Fts W)。
利用DNAMAN對APP不同血清型ftsW氨基酸序列進(jìn)行比對分析顯示:從已報道的ftsW序列比對發(fā)現(xiàn)來源不同血清型的ftsW序列具有100%的同源性(圖3)。
本研究從App基因組中擴(kuò)增了一個App ftsW基因。該基因全長606bp,含有一個開放閱讀框(ORF),起始密碼子為ATG,終止密子為TTT,編碼201個氨基酸。為一跨膜蛋白。功能分析發(fā)現(xiàn)其為肽聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶(FtsW)。
圖3 APP不同血清型ftsW的蛋白質(zhì)序列比對分析
圖 2 App ftsW跨膜區(qū)分析
大腸桿菌的研究表明肽聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶是細(xì)菌的細(xì)胞分裂時細(xì)胞壁的延伸所必須,同時還參與細(xì)菌細(xì)胞形狀的維持作用。研究發(fā)現(xiàn)有一類對熱敏感的相關(guān)基因fts(filamentou temperature sensitive,fts)參與了細(xì)菌的細(xì)菌細(xì)胞分裂過程。Fts突變體表現(xiàn)為分裂活動隨外界環(huán)境的溫度升高時而出現(xiàn)短暫的停滯,同時可見不分裂的長絲狀菌體;但是外界生長溫度適宜時,細(xì)菌分裂活動又能恢復(fù)正常的活動。研究表明,在細(xì)菌進(jìn)行分裂前,首先需要形成一個分裂復(fù)合體,該復(fù)合體體由多個分裂相關(guān)蛋白組成。FtsZ是一種微管蛋白。細(xì)菌分裂時ftsZ在分裂位點(diǎn)上組裝成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu),稱為Z-環(huán)。分裂復(fù)合體的其它蛋白附著在Z-環(huán)上形成細(xì)胞分裂的結(jié)構(gòu)。Z-環(huán)形成后,待分裂細(xì)胞形成分裂隔膜,進(jìn)一步分裂成兩個細(xì)胞。FtsW對Z-環(huán)的穩(wěn)定性起重要作用。由于App FtsW的高度保守性膜蛋白及其重要功能,因此其可能作為未來研究疫苗和藥物的對象。
FtsW蛋白在APP各血清型的同源性甚高,ftsW可能成為廣譜藥物的靶點(diǎn),免疫動物可能產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)作用。