陳群 石琴

[摘要] 目的 探討非小細(xì)胞肺癌（non-small lung cancer， NSCLC）患者血清miR （microRNA）系列基因表達(dá)水平及與化療療效的相關(guān)性。 方法 2011年3月～2016年9月選擇200例未經(jīng)任何抗癌治療的NSCLC患者作為NSCLC組，100例健康志愿者作為健康組，分別收集血清樣本；25例晚期NSCLC患者化療前和化療后的血清樣本。采用qRT-PCR方法檢測(cè)NSCLC組和健康組中血清miR系列基因表達(dá)水平，判斷血清miR系列基因表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果 NSCLC組的血清miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1基因表達(dá)與健康組存在差異（P<0.01）。NSCLC患者的血清上述基因表達(dá)化療前與化療后存在明顯差異（P<0.05）；健康組的血清miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1基因表達(dá)與化療前患者存在明顯差異（P<0.05），與化療后的患者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 NSCLC患者血清存在高水平miR系列基因表達(dá)，化療可降低miR系列基因表達(dá)水平，上述6種miR基因血清表達(dá)有助于NSCLC的診斷、預(yù)測(cè)和預(yù)后的判斷，聯(lián)合檢測(cè)有助于敏感性的提高。

[關(guān)鍵詞] 非小細(xì)胞肺癌；miR系列基因；預(yù)測(cè)；預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）15-0018-04

Study on the correlation between the expression level of serum miR gene and chemotherapy efficacy in NSCLC patients

CHEN Qun SHI Qin

Department of Oncology， Fuzhou Pulmonary Hospital of Fujian， Clinical Teaching Hospital of Fujian Medical University， Fuzhou 350008， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between the expression levels of serum miR（microRNA） gene and chemotherapy efficacy in the patients with non-small cell lung cancer（NSCLC）. Methods From March 2011 to September 2016， 200 NSCLC patients without any anticancer treatment were selected as the NSCLC group. 100 healthy volunteers were selected as the healthy group. Serum samples were collected separately； serum samples before and after chemotherapy in 25 patients with advanced NSCLC were collected. The qRT-PCR method was used to detect the expression level of serum miR gene in NSCLC group and healthy group， and the relationship between the expression level of serum miR gene and prognosis was determined. Results The serum levels of miR-19a， miR-19b-1， miR-20a， miR-17-3p， miR-18a， and miR-92-1 in the NSCLC group were different from those in the healthy group（P<0.01）. There were significant differences in the expressions of the above genes before and after chemotherapy in the serum of NSCLC patients（P<0.05）； the serum levels of miR-19a， miR-19b-1， miR-20a， miR-17-3p， miR-18a and miR-92-1 in the healthy group were significantly different from those before chemotherapy（P<0.05）. There was no statistical difference compared with the patients after chemotherapy（P>0.05）. Conclusion There is a high level of miR gene expression in the serum of NSCLC patients. Chemotherapy reduces miR gene expression levels. The above six miR gene serum expressions contribute to the diagnosis， prediction and prognosis of NSCLC. The joint detection helps increase sensitivity.

[Key words] Non-small cell lung cancer （NSCLC）； miR gene； Prediction； Prognosis

中國(guó)惡性腫瘤中發(fā)病率和病死率最高的是肺癌，而且非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占85%，常見(jiàn)臨床分期是ⅢB或Ⅳ期?；熞廊皇峭砥贜SCLC不可替代的手段，其治療目標(biāo)是延長(zhǎng)患者總生存期（OS）、提高生活質(zhì)量（QOL）、降低疾病相關(guān)的并發(fā)癥。雖然，針對(duì)肺癌的化學(xué)預(yù)防和治療已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但肺癌治療效果依舊不佳，近年來(lái)的研究表明肺癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的多基因調(diào)控的多階段、多步驟過(guò)程。因此，從基因表達(dá)調(diào)控方面研究肺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，了解肺癌治療預(yù)測(cè)的相關(guān)因素，能更精準(zhǔn)預(yù)測(cè)化療療效，優(yōu)化治療方案，提高肺癌患者的生活質(zhì)量和遠(yuǎn)期生存率已經(jīng)十分必要。microRNA（miRNA）是一類具有在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)功能的非編碼小分子miRNA，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、代謝、凋亡等方面都有著重要的作用。通過(guò)監(jiān)測(cè)NSCLC患者血清miR系列基因化療前后的變化，從而確定化療效果。本研究涉及6個(gè)指標(biāo)miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1的血清檢測(cè)，主要是觀察比較NSCLC患者化療前后血清miRNA的表達(dá)水平的改變，分析該改變對(duì)化療療效的影響，為血清miRNA在NSCLC治療中的相關(guān)研究提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例收集 分別收集2011年3月～2016年9月間的225例經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞檢查證實(shí)的NSCLC患者，其中，200例采集抗癌治療前的血清樣本，作為NSCLC組，男133例，女67例，中位年齡65歲；另外，25例為晚期NSCLC患者，給予至少2個(gè)周期以上的常規(guī)一線化療，分別采集化療前和化療2個(gè)療程后的血清樣本，作為治療組，男16例，女9例，中位年齡63歲。選取100例正常體檢且各項(xiàng)指標(biāo)正常的健康體檢者的血清樣本，作為健康組，男63例，女37例，中位年齡59歲。三組對(duì)象在性別、年齡方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。按期整理臨床治療資料。

1.1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)[1，2] 患者年齡18～75歲，男女不限；化療患者具有化療的指征，ECOG評(píng)分0～1分；生存時(shí)間≥3個(gè)月；具有可測(cè)量的病灶，胸片、普通CT或MRI掃描病灶≥20 mm，螺旋CT或PET-CT掃描病灶≥10 mm；機(jī)體上沒(méi)有未愈合的創(chuàng)傷；體檢符合要求，外周血象：WBC≥4.0×109/L，PLT≥80×109/L，Hb≥90 g/L。腎功能：Cr≤2.0×UNL（正常上限）。肝功能：BIL≤2.0×UNL，ALT/AST≤5.0×UNL。心電圖基本正常；依從性好，配合血清樣本采集。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)[1，2] 不符合入選標(biāo)準(zhǔn)者；具有嚴(yán)重的心肺功能衰竭；腹瀉（水樣便）或麻痹性腸梗阻；無(wú)法進(jìn)行療效評(píng)價(jià)者；未得到控制的糖尿??；急性感染；孕婦和哺乳期婦女；健康組曾患有惡性腫瘤，NSCLC患者合并第二原發(fā)惡性腫瘤。

1.1.4 剔除標(biāo)準(zhǔn)[1，2] 未按上述標(biāo)準(zhǔn)入組并完成有關(guān)檢查治療者；因故和無(wú)故明顯推遲給藥時(shí)間超過(guò)2周者。觀察期間合并使用其他抗腫瘤化療藥物者；化療患者觀察期間對(duì)靶病灶同時(shí)進(jìn)行放療者，或兼做其他抗腫瘤方案者。

1.2 方法

1.2.1 RNA分離提取 按照試劑說(shuō)明書，血清的total RNA 使用microRNAs Isolation Kit（Applied Biosystems，F(xiàn)orster City，CA，USA）抽提。total RNA溶于DEPC處理水中，-80℃保存。RNA濃度使用Nanodrop 2100（Nanodrop，Wilmington，DE）測(cè)量。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）分析 差異表達(dá)使用兩步方法的實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析。第一步cDNA的反轉(zhuǎn)錄，第二步是實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。miRNA的反轉(zhuǎn)錄相關(guān)操作按照試劑盒One Step PrimeScript?；microRNA cDNA Synthesis Kit（Takara，Tokyo，Japan）操作說(shuō)明進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為[3，4]：2×microRNA Reaction Buffer Mix 10 μL，0.1%BSA 2 μL，microRNA Prims Script?；RT Enzyme Mix 2 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free ddH2O 5 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃ 60 min，85℃變性5 s。microRNA的實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)遵照試劑盒SYBR?；Premix EX TaqTM Ⅱ（Takara，Tokyo，Japan）操作說(shuō)明進(jìn)行，實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)體系為SYBR?；Premix EX TaqTM Ⅱ 12.5 μL，PCR Forward Primer 1 μL，Uni-miR qPCR Primer 1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火和延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。定量PCR使用ABI7900的Fast real time PCR system（Applied Biosystems，Carlsbad，CA）執(zhí)行，每個(gè)樣本平行重復(fù)3次，采用U6 snRNA 做參考基因，2-△△Ct method 用于計(jì)算基因表達(dá)倍數(shù)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析使用SPSS21.0軟件（SPSS，Inc.，美國(guó)），所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間數(shù)據(jù)使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組與健康組血清miRNA基因表達(dá)比較

由表1可知未經(jīng)抗癌治療的NSCLC患者的血清miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1基因表達(dá)較健康組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.2 化療前、后的血清miR系列基因表達(dá)比較

25例晚期NSCLC患者化療前和化療2個(gè)療程后的血清miR系列基因表達(dá)水平，見(jiàn)表2。NSCLC組化療2個(gè)療程后的患者的血清miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1基因表達(dá)與化療前存在明顯差異（P<0.05）；健康組的血清miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1基因表達(dá)與化療前患者存在明顯差異（P<0.05），與化療后的患者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

肺癌是當(dāng)今發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，化療是晚期NSCLC不可替代的常用治療手段，但缺乏可靠的療效預(yù)測(cè)和生存預(yù)后方法。miRNA是一類小的、不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。miRNA在腫瘤生長(zhǎng)、增殖、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移、侵襲等方面起主要作用，Yan等研究[5]顯示，約50%的miRNAs基因位于腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域或脆性位點(diǎn)，而且不同類型的腫瘤中具有明顯不同的miRNAs表達(dá)譜[6]，某些關(guān)鍵miRNA表達(dá)水平的失衡可能是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素。血清miRNA可作為多種人類疾病的標(biāo)志物[7]，研究顯示[8-11]，循環(huán)血miRNA在食道癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的早期診斷、腫瘤分期和預(yù)后效果等方面具有重要的警示作用。

在NSCLC的研究中[12-15]，顯示miR系列中的部分基因包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤患者的血清中存在穩(wěn)定的高表達(dá)，極少受外界環(huán)境及自身的生理狀態(tài)的影響，而且化療后明顯降低，可成為很好的評(píng)價(jià)化療的效果[16，17]。Yu等[18]對(duì)112例NSCLC患者進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)Cox模型和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分發(fā)現(xiàn)了5個(gè)預(yù)測(cè)NSCLC治療效果的miRNA信號(hào)，檢測(cè)循環(huán)血中的miRNA不失為一種非侵襲性診斷和治療肺癌有價(jià)值的方法，還可以預(yù)測(cè)和檢測(cè)某些藥物的治療效果[19]。但是大部分學(xué)者只研究1個(gè)miRNA基因或2個(gè)，評(píng)價(jià)腫瘤治療的效果十分有限。另外，腫瘤的生物學(xué)指標(biāo)的表達(dá)可能與臨床病理特征和預(yù)后間存在一定的關(guān)聯(lián)。因此，準(zhǔn)確判定晚期肺癌的預(yù)后因素仍存在挑戰(zhàn)。除去單因素風(fēng)險(xiǎn)因子的考慮外，聯(lián)合的miRNA基因表達(dá)水平分析能否進(jìn)一步提高肺癌預(yù)后的準(zhǔn)確性？

本項(xiàng)目擬在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入研究miRNA基因簇成員（miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1）在NSCLC血清中的表達(dá)情況，分析血清表達(dá)水平與化療療效和生存期的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上，對(duì)于有意義的miRNA聯(lián)合為一個(gè)參考指標(biāo)，比較NSCLC患者化療前后血清miRNA的表達(dá)水平的改變，探討其對(duì)肺癌預(yù)測(cè)和預(yù)后的影響。本研究將有助于進(jìn)一步了解miRNA基因簇成員在NSCLC的作用，并作為其療效和生存等分子標(biāo)志物的依據(jù)。結(jié)果顯示，miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1在NSCLC患者血清中的表達(dá)水平明顯較健康人群上調(diào)，說(shuō)明更多的血清miRNA有助于NSCLC的診斷，而且部分早期的NSCLC患者就有多項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)水平顯著高于健康人群，有必要進(jìn)一步研究其在NSCLC早期診斷的價(jià)值。此外，化療明顯降低上述基因在晚期NSCLC患者血清中的表達(dá)水平，說(shuō)明上述6種血清miR基因有助于晚期NSCLC患者化療的療效預(yù)測(cè)。另外，患者分期愈晚，上述6種血清miR基因呈現(xiàn)高表達(dá)的項(xiàng)次愈多；而高表達(dá)項(xiàng)次愈多，其生存期也愈短，說(shuō)明6種血清miR基因有助于預(yù)后的判斷，聯(lián)合檢測(cè)也有助于提高敏感性和特異性。當(dāng)然，血清miR基因能否作為NSCLC患者臨床診斷、預(yù)后、預(yù)測(cè)的指標(biāo)，不僅僅是血清有否高表達(dá)，還需明確閾值以及聯(lián)合檢測(cè)的意義，尚需更多的研究來(lái)驗(yàn)證。

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（收稿日期：2018-01-09）