常振華，侯佳雯，宋恩亮，成海建，陳 宏，雷初朝*

(1.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西渭南 714000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟南 250100)

渤海黑牛原稱"無棣黑牛"，又稱"抓地虎牛"，原產(chǎn)于山東省濱州市，中心產(chǎn)區(qū)包括無棣縣、沾化縣、陽信縣和濱城區(qū)，在山東省的東營、德州、濰坊三市和河北滄州市均有分布。它具有早熟、繁殖性能好、屠宰率高、耐粗飼、抗逆性強、肉質(zhì)大理石紋明顯、遺傳性能穩(wěn)定等優(yōu)點，是我國少有的黑色毛色地方良種牛資源[1]。在分子水平上，王建英等[2]通過對渤海黑牛和日本和牛線粒體DNA遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)二者親緣關(guān)系較近，渤海黑牛含有歐洲型原牛和瘤牛型原牛的血統(tǒng)；周芬娜等[3]利用RAPD標(biāo)記檢測魯西黃牛和渤海黑牛遺傳多樣性，結(jié)果顯示渤海黑牛的遺傳多樣性顯著低于魯西牛；任艷玲等[4]通過分析渤海黑牛mtDNA Cytb基因遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性較豐富。

Y染色體遵循父系遺傳，具有突變率低，單倍型完整，不易受重組和回復(fù)突變等因素影響等優(yōu)點，是探究家畜父系遺傳多樣性、起源和進化的重要工具[5]。G?therstr?m等[6]利用5個Y-SNPs標(biāo)記將黃牛Y染色體單倍型組分為普通牛Y1、Y2和瘤牛Y3單倍型組；Edwards等[7]發(fā)現(xiàn)牛的4個Y-STRs位點可以區(qū)分普通牛和瘤牛起源，可以用來研究雜交牛的基因漸滲情況；Li等[8]利用4個Y-SNPs標(biāo)記和2個Y-STRs標(biāo)記對16個中國黃牛品種進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)中國黃牛主要存在普通牛Y2和瘤牛Y3 2個父系起源，并且各品種的Y染色體單倍型組呈現(xiàn)出清晰的地理分布規(guī)律。迄今為止，關(guān)于渤海黑牛Y染色體遺傳多樣性的研究較少[8]。本研究利用2個Y-SNPs標(biāo)記(UTY-19和ZFY-10)和2個Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)對渤海黑牛Y染色體遺傳多樣性和父系起源進行研究，以期為渤海黑牛品種資源保護和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集及基因組DNA提取

從山東省無棣縣渤海黑牛保種場采集純種渤海黑牛公牛耳組織樣15個，同時采集與日本和牛改良的渤海黑牛公牛樣本15個。將樣品置于75%酒精中帶回并保存，采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，稀釋濃度至20 ng/μL保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴增

參照Gotherstrom等[6]和Ginja等[9]報道的2個家牛Y-SNPs標(biāo)記(即UTY-19和ZFY-10)和Edwards等[10]報道的家牛2個經(jīng)典的Y-STRs位點標(biāo)記(INRA189和BM861)，引物信息詳見表1,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR擴增體系總體積為12.5 μL，其中，2×TaqMasterMix 6.25 μL，上、下游引物各0.25 μL(10 pmol/μL)，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 5.25 μL。

PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，Ta℃(表1)退火30 s，72℃延伸30 s，36個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳(含GoldView核酸染料)檢測。

1.3 測序和數(shù)據(jù)分析

將PCR純化產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。利用DNASTAR 7.1(DNASTAR, Madison, WI, USA)軟件對UTY-19和ZFY-10的測序結(jié)果進行分析，找出相應(yīng)的SNP和Indel位點；用GeneMarkerV1.91軟件[11]對熒光微衛(wèi)星標(biāo)記INRA189和BM861的等位基因大小進行統(tǒng)計。參考Edwards等[10]和Li等[8]報道的Y染色體單倍型(Y-SNP-INRA189-BM861)判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合單倍型組結(jié)果和Y-STRs檢測結(jié)果確定渤海黑牛不同個體的單倍型，再用ARLEQUIN V3.11軟件進行單倍型多樣度(H±SD)計算。

2 結(jié)果與分析

通過對30頭渤海黑牛2個Y-SNPs標(biāo)記(即UTY-19和ZFY-10)PCR擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果顯示，30頭渤海黑牛包含Y1、Y2和Y3 3種單倍型組。其中15頭純種渤海黑牛中普通牛Y1單倍型組所占頻率為6.67%，普通牛Y2單倍型組所占頻率為20.00%，瘤牛Y3單倍型組所占頻率為73.33%；15頭與日本和牛雜交改良的渤海黑牛中Y1單倍型組所占頻率為40.00%，Y2單倍型組所占頻率為26.67%，Y3單倍型組所占頻率為33.33%。

利用2個Y-STR標(biāo)記INRA189和BM861分析渤海黑牛Y染色體的多態(tài)性，結(jié)果顯示，INRA189標(biāo)記在30頭渤海黑牛中存在3個等位基因，其中98 bp等位基因?qū)?yīng)Y1單倍型組，102 bp等位基因?qū)?yīng)Y2單倍型組，88 bp等位基因?qū)?yīng)Y3單倍型組。在BM861位點中，渤海黑牛的等位基因大小為158 bp和156 bp，分別對應(yīng)普通牛(Y1和Y2)和瘤牛(Y3)單倍型組。

通過Y-SNPs和Y-STRs標(biāo)記聯(lián)合分析，在30頭渤海黑牛中確認(rèn)出3種單倍型(表2)。其中，15頭純種渤海黑牛中普通牛Y1單倍型Y1-98-158所占頻率為6.67%(1/15)，普通牛Y2單倍型Y2-102-158所占頻率為20.00%(3/15)，瘤牛Y3單倍型Y3-88-156所占頻率為73.33%(11/15)，單倍型多樣度為0.4476±0.1345；15頭與日本和牛雜交改良的渤海黑牛中檢測出普通牛Y1單倍型Y1-98-158所占頻率為40.00%(6/15)，普通牛Y2單倍型Y2-102-158所占頻率為26.67%(4/15)，瘤牛Y3單倍型Y3-88-156所占頻率為33.33%(5/15)，單倍型多樣度為0.7048±0.0535。

表1 家牛Y染色體特異性標(biāo)記PCR信息

表2 渤海黑牛Y染色體單倍型頻率及多樣度

3 討論

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，Y-SNPs和Y-STRs分子遺傳標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于群體遺傳多樣性和父系起源研究[5-10]。Li等[8]通過對中國16個黃牛品種Y染色體研究，發(fā)現(xiàn)中國黃牛Y染色體單倍型組存在明顯的地理分布規(guī)律，即北方黃牛主要為普通牛Y2單倍型組，南方黃牛主要為瘤牛Y3單倍型組，中原黃牛存在Y2和Y3兩種單倍型組；夏小婷等[12]結(jié)合Y-SNP和Y-STRs標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)關(guān)嶺牛具有普通牛Y2和瘤牛Y3兩種父系起源，父系遺傳多樣性較低。

渤海黑牛是我國少有的黑色毛色地方良種，其牛肉在香港市場頗受歡迎[1]。本研究通過對15頭純種渤海黑牛和15頭與日本和牛雜交改良的渤海黑牛公牛進行Y-SNPs分析研究，發(fā)現(xiàn)純種渤海黑牛中，普通牛Y2和瘤牛Y3所占比例最高，分別為20.00%和73.33%。該結(jié)果與Li等[8]中原黃牛為普通牛和瘤牛共同起源觀點一致，這可能是普通牛和瘤牛在長期的歷史進化過程中，分別從東南方向和西北方向進入我國，并在中原地區(qū)匯合的結(jié)果。其中，在15頭與日本和牛雜交改良的渤海黑牛中檢測出比例較高的普通牛Y1單倍型組(40.00%)。馬志杰等[13]利用USP9Y基因研究發(fā)現(xiàn)日本和牛存在普通牛Y1單倍型組和Y2單倍型組，因此推測雜交渤海黑牛中的大量Y1單倍型組來源于用來雜交改良渤海黑牛的日本和牛Y染色體?；诰€粒體DNA，王建英等[2]通過對渤海黑牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)渤海黑牛為普通牛和瘤牛混合起源。本研究聯(lián)合Y-SNPs和Y-STRs標(biāo)記分析，15頭純種渤海黑牛Y染色體鑒定出3種單倍型，即普通牛Y1-98-158、Y2-102-158和瘤牛Y3-88-156，說明渤海黑牛Y染色體主要以瘤牛為主，同時兼有Y2普通牛血統(tǒng)，Y1普通牛血統(tǒng)很可能是日本和?；驖B入所致，所占比例極低。本研究表明渤海黑牛的父系起源和母系起源是一致的，即為普通牛和瘤牛混合起源。

單倍型多樣度(H±SD)是衡量群體遺傳多樣性的重要指標(biāo)之一。Edwards等[10]發(fā)現(xiàn)138個國外牛品種的單倍型多樣度為0.422±0.3；Li等[8]報道的16個中國黃牛品種單倍型多樣度平均值為0.6831±0.0134，其中5頭渤海黑牛的單倍型多樣度為0.4000±0.2373。本研究發(fā)現(xiàn)，15頭純種渤海黑牛的Y染色體單倍型多樣度為0.4476±0.1345，與Li等[8]報道的渤海黑牛單倍型多樣度相近，且接近于國外牛品種的平均值，表明渤海黑牛具有相對較高的遺傳多樣性，遺傳基礎(chǔ)較豐富。15頭與日本和牛雜交改良的渤海黑牛，其生長速度明顯加快，更接近肉牛體型，豐富了渤海黑牛雜交牛的群體遺傳結(jié)構(gòu)，但應(yīng)該注意與渤海黑牛原種分開飼養(yǎng)，不能混群。因此，應(yīng)當(dāng)加強對渤海黑牛種質(zhì)資源的保護，建立建全保種體系，促進渤海黑牛種質(zhì)資源的開發(fā)和利用。