張占田 孫雅菲 艾昊 羅聞?wù)?馮冰 孫文獻 徐國華 孫淑斌

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水稻轉(zhuǎn)錄因子基因的表達特征及其在營養(yǎng)生長中的調(diào)控作用

張占田 孫雅菲 艾昊 羅聞?wù)?馮冰 孫文獻 徐國華 孫淑斌*

(南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院, 南京 210095;*通訊聯(lián)系人, E-mail: sunshubin@njau.edu.cn)

【目的】水稻(LOC_Os03g31880)基因為擬南芥的同源基因，與、和同屬于水稻GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族。已有研究報道，轉(zhuǎn)錄因子基因和共同調(diào)控植物根系、葉片的發(fā)育，并參與各項生命活動。本研究旨在闡明在水稻中的時空表達特征及其在營養(yǎng)生長中的調(diào)控作用?！痉椒ā客ㄟ^生物信息學分析、表達模式分析、萌發(fā)動力學分析和水培實驗驗證該基因的功能?！窘Y(jié)果】生物信息學分析發(fā)現(xiàn)、、和與擬南芥和其他物種的亞家族和亞家族成員具有很高的序列一致性；表達模式和pOsSHR2::GUS材料染色分析發(fā)現(xiàn)，在整個生長發(fā)育過程中的根系、葉片、維管組織和生殖器官中表達強烈，并集中在根尖的中柱、側(cè)根原基和葉片及莖維管組織的中心表達，在野生型的地上部和根系中，受缺磷影響下調(diào)表達；對獲得的的CRISPR-Cas9突變體進行種子萌發(fā)實驗和水培實驗，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，的萌發(fā)時間延后，萌發(fā)率降低，在正常供磷和缺磷處理下，的地上部和根系長度顯著小于野生型?！窘Y(jié)論】在地上部和根系的發(fā)育、維管組織形成以及營養(yǎng)與生殖生長中具有重要作用，這為今后在分子育種等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

水稻；；時空表達特征；營養(yǎng)生長；磷

隨著日愈復(fù)雜的環(huán)境變化以及日愈多樣化的人類需求，我國的水稻育種重點也不僅限于產(chǎn)量育種，科研工作者也側(cè)重水稻品質(zhì)多樣性、環(huán)境高適應(yīng)和低資源投入，這些對水稻分子育種提出了更高的要求。因此，不僅僅需要持續(xù)深入系統(tǒng)地了解水稻重要農(nóng)藝性狀的生長發(fā)育分子機制，還要完善現(xiàn)有分子育種相關(guān)的種質(zhì)資源信息系統(tǒng)，培育具有雜種優(yōu)勢與理想基因型的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、耐逆抗病的水稻新品種[1]。

細胞分裂、增殖和分化的主要調(diào)節(jié)者是轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合啟動基因的表達，最終決定細胞和完整組織的特征，從而調(diào)控植物的發(fā)育過程[2]。水稻(short root 2，LOC_Os03g31880)與擬南芥高度同源，與(short root 1，LOC_Os07g39820)、(scarecrow 1，LOC_ Os11g03110)、(scarecrow 2，LOC_Os12g02870)同屬于水稻GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族[3-6]。之前研究顯示了在不同物種中和同源基因的時空表達模式具有很高的保守性。擬南芥主根的結(jié)構(gòu)是圍繞中柱的3個同心單細胞層組成的基本組織，從根的外部依次為表皮、皮層和內(nèi)皮層[7]，對植物體主根時空表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)和分別定位在擬南芥主根的中柱和內(nèi)皮層中[8,9]，AtSHR蛋白能激活的轉(zhuǎn)錄表達，與共同調(diào)控擬南芥主根基本組織形成的模式[4,5]，水稻同源基因(和)和雙穗短柄草同源基因()轉(zhuǎn)入擬南芥突變體驗證了同源基因在根系基本組織形成和植株生長的相似功能[6]。在水稻中，和分別定位在根中柱和內(nèi)皮層中[10]；在玉米中，在根內(nèi)皮層和靜止中心(quiescent center)表達[11]；在白羽扇豆中，和在根的內(nèi)皮層及靜止中心共表達[12]；在小黑楊中，在小黑楊根尖的中柱表達[13]。對植物體胚發(fā)育過程中的時空表達模式分析表明，定位在擬南芥具有平周細胞分裂特性的胚初始細胞中[14]。在水稻發(fā)育早期種子、幼穗和胚中表達量較高[15]。對植物體葉片發(fā)育過程中的時空表達模式分析，發(fā)現(xiàn)和分別在葉片維管束和維管束鞘中表達[16,17]，定位在小黑楊葉原基的前維管組織細胞的中心區(qū)域[13]，和在水稻葉片的氣孔、葉原基和葉舌發(fā)育前體細胞中表達，對氣孔、葉片和葉舌的形成具有重要作用[18]。對植物體側(cè)根發(fā)育過程中的時空表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)在擬南芥?zhèn)雀透约案杉毎斜磉_[19,20]，定位在側(cè)根靜止中心[21,22]，也在小黑楊側(cè)根中表達[13]。可見，在GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族基因中，亞家族和亞家族一致定位在植物體中根、葉片、維管組織和生殖器官，涉及根、葉片和維管組織的發(fā)育，與營養(yǎng)和生殖生長息息相關(guān)。

和同源基因在根系、葉片和種子胚中均有表達，調(diào)控組織細胞的分裂、增殖和分化，它們的缺失或沉默會顯著影響植物體的表型及生長發(fā)育。在擬南芥中，與野生型相比，突變體和根系變短，且葉片變小[8,9]，水稻同源基因(和)以及雙穗短柄草同源基因()轉(zhuǎn)入擬南芥突變體后其表型恢復(fù)且根系和葉片都有顯著增長[6]，但的部分沉默會加快擬南芥地上部和根系的生長速率[13]；白羽扇豆同源基因()沉默材料的根系長度和生物量顯著低于野生型[12]，但小黑楊同源基因()的沉默材料卻有更快的生長速率[13]。因此，推測同源基因調(diào)控植物體的生長存在劑量性效應(yīng)?？梢?，同源基因的缺失或沉默會差異調(diào)控植物的營養(yǎng)生長。

植物的生長離不開各種營養(yǎng)元素，而磷是植物生長必需的大量營養(yǎng)元素之一，參與植物體內(nèi)一系列的生長發(fā)育過程(光合作用和能量代謝等)，磷也是細胞內(nèi)DNA、RNA、蛋白質(zhì)、磷脂、ATP和ADP等生物大分子的重要結(jié)構(gòu)組成成分[23-25]。水稻中有很多基因家族響應(yīng)外界磷素變化，如磷轉(zhuǎn)運蛋白基因()家族[26-29]和MYB-CC轉(zhuǎn)錄因子基因()家族[30-33]等。白羽扇豆同源基因和在缺磷條件下根系的表達量沒有變化，但是調(diào)控了缺磷條件下排根的生成[12]。目前，水稻轉(zhuǎn)錄因子基因與磷素或者其他營養(yǎng)元素的響應(yīng)關(guān)系還未見報道。

本研究通過生物信息學分析、實時熒光定量qRT-PCR、GUS染色觀察、種子萌發(fā)動力學實驗和水培實驗探究的時空表達特征和在營養(yǎng)生長過程中的作用，為全面揭開在水稻中的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料包括東粳野生型(wild type，WT)、純合CRISPR-Cas9突變體和的啟動子接組織定位材料::。

1.2 不同物種的SHR和SCR同源基因生物信息學分析

水稻與、和同屬于GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族[3-6]。根據(jù)基因的登錄號在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和RGAP (http://rice.plantbiology.msu.edu/)網(wǎng)站上獲得相應(yīng)的核苷酸序列或氨基酸序列。利用DNAMAN軟件對序列進行氨基酸和核苷酸一致性分析；將氨基酸序列輸入基因家族分析網(wǎng)站InterPro (http:// www.ebi.ac.uk/interpro/)，分析基因的GRAS保守結(jié)構(gòu)域和VHIID基序的存在及位置；將部分已報道GRAS家族和同源基因氨基酸序列導(dǎo)入ClustalX和MEGA 5.0軟件制作進化樹，自展值(bootstrap)設(shè)為500。

1.3 組織定位材料和突變體材料的獲得及鑒定

1.3.1 組織定位材料(::)的獲得

利用 DNAMAN軟件對的啟動子序列進行酶切位點分析，結(jié)合表達載體1300GN確定使用限制性內(nèi)切酶dⅢ和Ⅰ，通過Primer Premier 5.0設(shè)計含有相應(yīng)酶切位點的特異性引物(F：5′-GCAGGATCCCCGACTCAAACAA-3′和R：5′-G AGGGTACCCCTGAAGAGGGTAT-3′)。利用特異性引物從水稻基因組中克隆了翻譯起始位點(ATG)上游2025 bp的啟動子序列，將PCR擴增獲得的啟動子片段克隆到克隆載體pEASY blunt上，測序驗證序列的正確性，利用dⅢ和Ⅰ從克隆載體pEASY blunt上雙酶切序列正確的片段，通過T4 DNA連接酶連接至帶有GUS報告基因的1300GN表達載體上，載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌EHA105中。運用水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過農(nóng)桿菌浸染粳稻成熟胚愈傷組織將表達載體轉(zhuǎn)入水稻基因組中，組織培養(yǎng)獲得T0材料。通過GUS染色和潮霉素篩選從構(gòu)建獲得的T0材料中鑒定出10個獨立的株系，從中挑選3個株系用于組織特異性分析。

1.3.2 突變體材料()的獲得

首先依據(jù)識別位點的要求選取2個靶點序列(5′-TTCCTCCCGCCAGTTCCACT-3′和5′-C GCCAGTTCCACTCGGGAAC-3′)，并將Ⅰ酶切位點整合到靶點序列，后將各引物合成并退火，與已被Ⅰ酶切的U3Pro::Ⅰ-Ⅰ::sgRNA載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。利用Gateway技術(shù)將pOs-sgRNA載體上的sgRNA和spacer序列置換到Ph-Ubi-cas9-7表達載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)測序驗證后，由農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，獲得CRISPR-Cas9突變體。小量快速提取T0各株系的DNA后，利用特異性引物擴增靶點序列并測序，從純合株系中選擇兩個不同靶點序列突變的株系和，進行后續(xù)種子萌發(fā)動力學實驗和水培實驗。

1.4 水稻的水培及田間盆栽實驗

將水稻種子用75％乙醇消毒1 min，再用稀釋的30％NaClO滅菌30 min，然后用去離子水沖洗干凈。種子在25℃的黑暗中萌發(fā)3 d，水培實驗在光周期16 h光照(30℃)/8 h黑暗(22℃)的人工氣候室中進行，相對濕度保持70％左右。將10 d苗齡的水稻幼苗去種子移入7 L中轉(zhuǎn)箱中，每箱20棵苗，轉(zhuǎn)移到完全營養(yǎng)液中；缺磷處理，則設(shè)置正常供磷營養(yǎng)液(0.3 mmol/L KH2PO4，+P)和缺磷營養(yǎng)液(0.0 mmol/L KH2PO4，―P)，缺磷處理的營養(yǎng)液中用0.3 mmol/L的KCl補足K+含量，其他營養(yǎng)成分參照國際水稻研究所水稻完全營養(yǎng)液配方。每個株系設(shè)置4次重復(fù)，每天調(diào)pH至5.5，每3 d換一次營養(yǎng)液。在水稻種子萌發(fā)動力學實驗和水培實驗中，連續(xù)測量并觀察記錄水稻種子及幼苗在生長過程中地上部和根系長度；采集水稻幼苗缺磷處理7 d的地上部和根系樣品，貯存于―70℃下，用于后續(xù)的缺磷表達模式分析和時空表達模式分析。

田間盆栽試驗在南京農(nóng)業(yè)大學牌樓基地試驗田進行，正常水肥管理，試驗所用土壤為江蘇省南京市地區(qū)酸性黃棕壤(pH=5.08)。田間盆栽實驗的水稻萌發(fā)和前期的生長與水培實驗一致，每個株系設(shè)置4次重復(fù)，將生長到21 d苗齡的水稻幼苗移入盆缽中盆栽至收獲。分別對::三個株系的苗期、揚花期和灌漿期不同組織、器官采樣，進行后續(xù)的GUS染色分析和時空表達模式分析。

1.5 pOsSHR2::GUS材料全生育期的GUS染色

將::材料3個株系置于田間進行盆栽實驗至收獲，期間分別在苗期、揚花期和灌漿期三個生長發(fā)育階段剪取不同組織部位浸沒在GUS染液[34]中，37℃下過夜染色，最后置于體視鏡下觀察染色組織部位。

1.6 植物組織樣品RNA提取和實時熒光定量PCR

使用Trizol試劑(Invitrogen)從貯存于－70℃冰箱中的不同組織部位樣品中提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A，TaKaRa)合成cDNA，SYBY定量RT-PCR試劑(DRR041A)進行實時PCR檢測。分析的時空表達模式和缺素表達模式。其中、和的定量引物分別是(F: 5′-CAACACCCCTGCTATGTACG-3′、R: 5′-CATC ACCAGAGTCCAACACAA-3′)、(F：5′-TGTGTGT CACGATCGACATTAATG-3′、R：5′-CGCTGTTTC AAAACCCTACATG-3′)和(F：5′-GCGGGTTGAAT GGGAAGAG-3′、R：5′-TGCTGGCTGAAAAACCC TAAG-3′)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用軟件Office Excel 2010、SigmaPlot 10.0和Adobe Photoshop CS6進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同物種SHR和SCR同源基因的生物信息學分析

為了探究在水稻中的功能，推測和同源基因在不同物種中的相似功能，對與不同物種和同源基因進行生物信息學分析。如圖1所示，水稻和亞家族基因與擬南芥對應(yīng)同源基因的氨基酸和核苷酸的序列一致性非常高，均超過40%(除外)。在水稻中，亞家族的氨基酸和核苷酸的序列一致性均超過65%，亞家族均超過50%(圖1-A)。可見，在擬南芥和水稻中，和同源基因氨基酸和核苷酸序列一致性非常高；對擬南芥與水稻和同源基因進行GRAS保守結(jié)構(gòu)域和VHIID基序的定位及預(yù)測，發(fā)現(xiàn)兩者的和同源基因都具有GRAS保守結(jié)構(gòu)域和VHIID保守基序(圖1-B)；對GRAS家族中的和同源基因的進化樹分析表明，不同物種和同源基因在單子葉與雙子葉植物、亞家族與亞家族成員具有明顯不同的保守進化關(guān)系(圖1-C)，可見，和同源基因在物種進化過程中高度保守。

2.2 OsSHR1和OsSHR2在水稻中的時空表達模式

為了分析和的時空表達模式，推測在水稻中的功能，以東粳野生型為實驗材料，進行田間盆栽實驗。在水稻生長發(fā)育過程中，分別在水稻的苗期(6周)、分蘗期(9周)、孕穗期(12周)、揚花期(14周)和灌漿期(16周)5個時期對水稻的不同部位(根、根莖結(jié)合處、葉片、葉鞘、劍葉、劍葉鞘、其他葉片、其他葉鞘、幼穗、莖、枝梗、穗軸、穎花和穎殼)進行取樣，提取RNA以及實時熒光定量PCR分析，檢測在水稻不同時期、不同組織中的表達強度。如圖2所示，在水稻不同時期，和的表達強度基本一致且在水稻多個組織部位均有表達，但在葉片和葉鞘中表達稍弱。在營養(yǎng)生長階段(苗期和分蘗期)，和在根系和莖基部表達最強烈，在葉片和葉鞘中表達較弱(圖2-A，B)；在生殖生長階段(孕穗期、揚花期和灌漿期)，和在根系表達最強烈，維管組織和生殖器官的表達略強，在葉片和葉鞘中表達稍弱(圖2-C~E)。推測和可能在水稻生長發(fā)育的各個時期都發(fā)揮重要作用。

2.3 OsSHR2在水稻中的組織定位分析

進一步研究在水稻組織器官中的時空表達特征，對獲得的::材料進行GUS染色分析(圖3)。在各時期各組織幾乎均有GUS表達。具體在根尖(圖3-A、B)、葉(圖3-C、D)、葉原基(圖3-E)、葉舌(圖3-F)、維管組織(莖、莖基部和節(jié))(圖3-G~J)、穎殼、小穗軸(圖3-K)和生殖器官(花絲、子房和胚)(圖3-L、M)中強烈表達；另外，集中在水稻根尖的中柱、側(cè)根發(fā)生處和葉片及莖維管組織的中心特異表達(圖3-A~D，I)。推測可能調(diào)控水稻根系基本組織和地上部維管組織的發(fā)育，在生長發(fā)育各時期的不同組織中發(fā)揮重要作用。

A－擬南芥和水稻的SHR和SCR同源基因氨基酸和核苷酸的序列一致性分析；B－通過基因家族分析網(wǎng)站InterPro(http://www.ebi.ac.uk/ interpro/)進行擬南芥與水稻的SHR和SCR同源基因GRAS保守結(jié)構(gòu)域和保守基序VHIID的位置預(yù)測；C－不同物種SHR和SCR同源基因的進化樹分析。

Fig. 1. Bioinformatics analysis ofandhomologous genes of different species.

2.4 OsSHR2正調(diào)控水稻的萌發(fā)及營養(yǎng)生長

為了探明對水稻種子萌發(fā)的影響，進行了水稻種子萌發(fā)動力學實驗(圖4)。與野生型相比，突變體在萌發(fā)14 d后地上部長度平均減少約39%，根系長度平均減少約15%(圖4-B、C)；與野生型相比，突變體萌發(fā)時間延后(圖4-A)、萌發(fā)率降低(數(shù)據(jù)未列)。根據(jù)突變體在水稻種子萌發(fā)過程中與野生型的差異和的表達定位，推測正調(diào)控水稻的萌發(fā)及營養(yǎng)生長。

圖2 OsSHR1和OsSHR2在水稻中的時空表達模式分析

Fig. 2. Temporal and spatial expression pattern ofandin rice.

A－種子根；B－種子根及側(cè)根；C－新葉；D－新葉的放大圖；E－葉原基；F－葉舌；G－莖節(jié)；H－莖及葉鞘；I－莖；J－莖基部；K－穎殼及小穗軸；L－穎花；M－子房和柱頭；N－胚(萌發(fā)后3 d)。A~E，J：水稻苗期；F，G，I，K~N：水稻灌漿期；H：分蘗期。A~J中標尺為2 mm；K~N中標尺為0.5 mm。

Fig. 3. Identification ofpromoter-driven tissue-specific GUS staining.

A－萌發(fā)表型(萌發(fā)后3 d、5 d和8 d)，標尺為5 cm；B－水培表型(萌發(fā)后14 d)，標尺為5 cm；C－材料地上部和根系長度統(tǒng)計(萌發(fā)后3 d、5 d、8 d和14 d)；DAG－萌發(fā)后天數(shù)。

Fig. 4. Phenotype and statistics of seed germination and hydroponics experiments of WT and.

A－OsSHR1和OsSHR2在水稻地下部的相對表達量；B－OsSHR1和OsSHR2在水稻地上部的相對表達量。

Fig. 5. Relative expression level ofandunder Pi-sufficient and Pi-deficient conditions in rice.

A和B－缺磷3 d；C和D－缺磷1周；E和F－缺磷2周；G－缺磷2周的表型, 標尺為20 cm。

Fig. 6. Phenotype of the wild type(WT) andunder Pi-sufficient and Pi-deficient conditions.

2.5 OsSHR1和OsSHR2在水稻正常供磷與缺磷條件下的表達模式分析

生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，和基因啟動子均包含缺磷響應(yīng)元件(W-BOX、PHO-like和P1BS)，推測和響應(yīng)缺磷，因此以東粳野生型為實驗材料進行水培實驗。缺磷處理7 d后，檢測和受缺磷相對表達量的變化。相對于正常供磷，缺磷條件下和在根系的相對表達量分別降低了52%和64%(圖5-A)；地上部相對表達量增長了1.8倍，降低了23%(圖5-B)。說明在地上部和根系對缺磷響應(yīng)不同，而地上部和根系受缺磷下調(diào)。推測和在地上部和根系可能對缺磷響應(yīng)機制不同，從而在水稻磷素吸收響應(yīng)過程中發(fā)揮不同的調(diào)控作用。

2.6 OsSHR2正調(diào)控水稻營養(yǎng)生長階段地上部和根系的長度

為了探究對水稻營養(yǎng)生長的影響和缺磷信號的響應(yīng)，進一步設(shè)計了不同磷處理條件下的水培實驗。如圖6所示，無論是正常供磷還是缺磷條件下，野生型地上部和根系的長度均大于突變體。缺磷2周時，與野生型相比，突變體地上部長度平均降低約13%，突變體根系長度平均降低約17%(圖6-E、F)；然而，野生型和突變體的地上部和根系長度在正常供磷和缺磷條件下的表型差異無明顯不同。說明的缺失影響水稻正常供磷和缺磷條件下的營養(yǎng)生長，但并不能推出受缺磷影響特異調(diào)控水稻營養(yǎng)生長表型。

3 討論

在擬南芥和其他物種中，和同源基因處于上下游關(guān)系，它們作為轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控植物根系和葉片的形成等生命活動。在對進行生物信息學分析的同時，研究、和的序列結(jié)構(gòu)信息可以進一步驗證同源基因在物種進化過程中極高的保守性和發(fā)揮的相似作用。(LOC_Os03g31880)位于水稻第3染色體上，DNA全長2475 bp，cDNA全長1812 bp，編碼603個氨基酸，只有1個外顯子。與、、同屬于水稻GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族[3-6]。VHIID基序是GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族的保守基序，它是使SHR同源蛋白具有正常的核定位和蛋白互作作用的關(guān)鍵保守基序[6]。生物信息學分析水稻及其同源基因的氨基酸和核苷酸的序列一致性、GRAS保守結(jié)構(gòu)域和VHIID保守基序[4-6]的預(yù)測定位以及物種進化關(guān)系(圖1)。根據(jù)以上3種生物信息學分析結(jié)果，推測同源基因在擬南芥和水稻中功能上的相似性、時空表達特征上的一致性和物種進化過程中的保守性。

在水稻中，作為在水稻中親緣關(guān)系最近的同源基因，在對進行時空表達特征分析的同時一并研究的時空表達特征也可以驗證SHR同源基因在物種進化過程中極高的保守性和發(fā)揮的相似作用。已有研究表明不同物種中同源基因具有相似的定位及功能，在植物體各組織器官中均有表達，在根尖中柱、側(cè)根、胚和葉片維管束中表達特異[6, 9-13]。本研究發(fā)現(xiàn)和在水稻不同時期不同組織器官均有表達，在水稻根、維管組織和生殖器官表達強烈，在根尖的中柱、側(cè)根發(fā)生處和葉片及莖的維管組織中心強烈表達?？梢姾团c其他物種同源基因的時空表達特征具有很高的一致性[6, 9-13]，這可能與擬南芥和水稻同源基因都具有VHIID[6]保守基序有關(guān)。說明和可能在水稻生長發(fā)育的各個時期、各個組織中發(fā)揮重要調(diào)控作用并調(diào)控根系基本組織和地上部維管組織的發(fā)育。缺失顯著影響水稻的萌發(fā)和地上部、根系的長度，說明在水稻的營養(yǎng)生長過程起非常重要的正調(diào)控作用。已有研究表明同源基因在擬南芥和小黑楊中劑量性地調(diào)控植株的營養(yǎng)生長[8, 9, 13]，可見，與其他物種同源基因在調(diào)控植物營養(yǎng)生長方面具有很高的保守性。

不同物種的同源基因調(diào)控植物對養(yǎng)分的利用機理鮮有報道[12]，但研究SHR同源基因與營養(yǎng)元素的關(guān)系具有非常重要的現(xiàn)實意義。在此基礎(chǔ)上，已知含缺磷響應(yīng)元件W-BOX、類PHO和P1BS[31,40]，即在水稻缺磷條件下的表達量增加。但是在正常供磷和缺磷條件下，突變體的地上部和地下部長度均小于野生型，說明并不特異調(diào)控缺磷條件下的水稻營養(yǎng)生長表型。推測響應(yīng)缺磷可能通過一條復(fù)雜的通路，與缺磷響應(yīng)基因共同調(diào)控植物體內(nèi)磷素的吸收和分配。

本研究表明，在物種進化過程中具有高度的保守性，而且它在水稻的不同時期、不同部位均有表達，其時空表達特征與其他物種同源基因有極高的一致性。在調(diào)控水稻萌發(fā)和營養(yǎng)生長過程中，我們推測了參與磷素的調(diào)控可能通過一條極為復(fù)雜的通路?？梢娹D(zhuǎn)錄因子對水稻各項生命活動至關(guān)重要，對該基因的研究可能在營養(yǎng)生長與分子育種方面有重要意義。

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Expression Patterns and Regulation of Transcription Factor Genein Vegetative Growth in Rice

ZHANG Zhantian, SUN Yafei, AI Hao, LUO Wenzhen, FENG Bing, SUN Wenxian, XU Guohua, SUN Shubin*

(College of Resources and Environmental Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;*Corresponding author, E-mail: sunshubin@njau.edu.cn)

【Objective】(LOC_Os03g31880) is a homologous gene ofof, which falls into GRAS transcription factor family together with,andin rice. It has been reported that the transcription factor genesandregulate the development of roots and leaves, and participate in various life activities. We analyzed the temporal and spatial expression patterns and the wayregulates vegetative growthin rice.【Method】The function ofwas verified by bioinformatics analysis, expression pattern analysis, germination kinetic analysis and hydroponic experiments.【Result】 Biomechanical analysis showed that,,andhad high homology withsubfamily andsubfamily inand other species. The expression pattern analysis by qRT-PCR and::staining showed thatwas strongly expressed in the roots, leaves, vascular tissues and reproductive organs during the whole vegetative and reproductive growth stages, and especially in the stele of the root tip,lateral root primordium and the central of leaf and stem vascular tissue. Additionally, the relative expression ofwas down-regulated in Pi-deficiency inshoots and roots of wild type. The seed germination and hydroponic experiment analysis of CRISPR-Cas9 mutantshowed that seed germinationofwas delayed and with lower germination rate than that of WT, in addition the length of shoot and root ofwere significantly shorter than WT under Pi-sufficient and Pi-deficient conditions.【Conclusion】plays an important role in the development of shoots and roots, the formation of vascular tissue and various activity in vegetative and reproductive growth, which lays an important theoretical basis for the application ofin molecular breeding.

rice;; temporal and spatial expression pattern; vegetative growth; phosphorus

Q755; S511.01

A

1001-7216(2018)05-0427-10

10.16819/j.1001-7216.2018.7037

2017-03-30；

2017-08-18。

國家自然科學基金資助項目(31672226)；國家轉(zhuǎn)基因植物研究計劃資助項目(2016ZX08009-003-005)；江蘇省自然科學基金資助項目(BK20141367)。