郭海燕

摘要：黑曲霉可以在四環(huán)素菌渣發(fā)酵中產(chǎn)生一系列酶，促進(jìn)菌渣中的蛋白、纖維素、多糖等物質(zhì)的分解。本研究用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)黑曲霉種子接種于四環(huán)素菌渣發(fā)酵體系中，有效發(fā)揮了黑曲霉在菌渣處理體系中的作用，優(yōu)化了處理效果，促進(jìn)四環(huán)素菌渣處理規(guī)模化，減少環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)資源的循環(huán)利用，保護(hù)環(huán)境。

Abstract： Aspergillus niger can produce a series of enzymes in the fermentation of tetracycline slag， promoting the decomposition of proteins， cellulose， polysaccharides and other substances in the slag. In this study， the Aspergillus niger seeds were inoculated into the tetracycline slag fermentation system by liquid culture medium， which effectively played the role of Aspergillus niger in the slag treatment system， optimized the treatment effect， promoted the scale treatment of tetracycline slag treatment， and reduced environmental pollution， realizing the recycling of resources and protecting the environment.

關(guān)鍵詞：黑曲霉；四環(huán)素菌渣；發(fā)酵；液體培養(yǎng)

Key words： Aspergillus niger；tetracycline slag；fermentation；liquid culture

中圖分類號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-4311（2018）29-0238-03

0 引言

黑曲霉具有多種活性較強(qiáng)的酶系，如纖維素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶等，可將原料中的纖維素、蛋白質(zhì)等大分子化合物降解轉(zhuǎn)化為易消化利用的養(yǎng)分，并為酵母菌等提供必需的糖、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，黑曲霉和酵母菌在同一個(gè)發(fā)酵體系內(nèi)混種培養(yǎng)可以協(xié)同作用，相互促進(jìn)生長(zhǎng)，尤其酵母菌生長(zhǎng)比較旺盛。在四環(huán)素菌渣發(fā)酵中加入黑曲霉和酵母菌混合培養(yǎng)，發(fā)酵效果明顯好于酵母菌純種降解菌渣，氨基氮水平高于純種培養(yǎng)體系，氨基酸含量有明顯升高，發(fā)酵過程中泡沫明顯減少，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液具有酵母芳香氣味。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

15L種子罐；50L發(fā)酵罐；高效液相色譜儀；奧林巴斯CX31拍照顯微鏡。

啤酒酵母冷凍液（自保藏）；

黑曲霉固體斜面孢子（自保藏）。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 氨基酸測(cè)定方法

高效液相色譜法

色譜條件（表1）。

色譜柱：Aglient C18柱，流動(dòng)相A ：8g/L無水醋酸鈉（pH7.2）-四氫呋喃-三乙胺（994：6：0.2）；流動(dòng)相B：甲醇-乙腈-4g/L無水醋酸鈉（pH7.2）（450：350：200）。

1.2.2 氨基氮測(cè)定方法

甲醛滴定法：稱取樣品5g（精確至0.002g），加水溶解定容至100mL。吸取樣品溶液5.0mL于100mL燒杯中，加入55mL水，用0.05mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至pH=8.20，并保持1min不變，此結(jié)果為游離酸度，不予計(jì)量體積，慢慢加入36%甲醛溶液10mL，放置1min后，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH=9.20，記錄消化氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)。同時(shí)做空白試驗(yàn)，記錄加入甲醛溶液后，空白試驗(yàn)所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定溶液的毫升數(shù)。

氨基氮的含量按式（1）計(jì)算，其數(shù)值以%表示。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

四環(huán)素菌渣發(fā)酵采用二級(jí)發(fā)酵方式，用種子罐分別培養(yǎng)黑曲霉和酵母菌，增值酵母菌數(shù)量和黑曲霉菌絲量，將一定種齡的種子液移入菌渣發(fā)酵培養(yǎng)基中，按一定條件培養(yǎng)。

①酵母菌種子液培養(yǎng)方法：將活化酵母種液按1-3%的接種量接種到如下培養(yǎng)基中：蛋白胨2.0%、酵母浸膏1.0%、葡萄糖2.0%。

培養(yǎng)條件：溫度30-31℃，通氣比1：0.5L/L/min，培養(yǎng)60-70hr移入菌渣培養(yǎng)基中。

②黑曲霉種子液液體培養(yǎng)方法：將黑曲霉孢子懸浮液按1-3%的接種量接種到如下培養(yǎng)基中：蛋白胨0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，酵母浸粉0.2%，硫酸鎂0.05%，葡萄糖2.0%。

培養(yǎng)條件：溫度34-35℃，通氣比1：0.5L/L/min，培養(yǎng)60-70hr移入菌渣培養(yǎng)基中。

③酵母純種菌渣發(fā)酵方法：將①的種子液按接種量5-10%接種到如下培養(yǎng)基中：四環(huán)素菌渣80-85%，葡萄糖0.5%。

培養(yǎng)條件：溫度30℃，通氣比1：0.5L/L/min，培養(yǎng)120hr結(jié)束培養(yǎng)。

④黑曲霉和啤酒酵母混種發(fā)酵方法：將①和②的種子液混合接入菌渣培養(yǎng)基中，接種量各5-10%，菌種培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件同③。

2 結(jié)果與討論

2.1 四環(huán)素菌渣中的營(yíng)養(yǎng)物分析

四環(huán)素發(fā)酵菌渣中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，主要為未利用完的大分子碳源氮源，如淀粉、黃豆餅粉等，還有菌絲自溶釋放的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如微量元素、菌體蛋白、小分子營(yíng)養(yǎng)物等，在四環(huán)素菌渣發(fā)酵中可以作為酵母或黑曲霉的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被分解利用，而無需添加更多的營(yíng)養(yǎng)成分。

2.2 在菌渣發(fā)酵中酵母、黑曲霉混種發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)分析

2.2.1 四環(huán)素菌渣經(jīng)酵母菌和黑曲霉混合發(fā)酵后，培養(yǎng)液有濃郁的酵母香味，顯微鏡鏡檢有大量的酵母菌，發(fā)酵料液較單獨(dú)使用酵母菌發(fā)酵的料液稀薄，但酵母量明顯增多，表明發(fā)酵體系中加入黑曲霉時(shí)，菌渣中的大分子淀粉、黃豆餅粉等殘留物被分解利用，料液粘度較低，酵母量增值較快。

隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中淀粉和黃豆餅粉的殘留物被分解，黑曲霉的生長(zhǎng)逐漸減弱，速效物質(zhì)被酵母菌充分利用，生長(zhǎng)速度加快，發(fā)酵體系中酵母菌越來越多，黑曲霉逐漸由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏而逐漸失去生長(zhǎng)能力，發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵料液中幾乎沒有黑曲霉菌絲。而在酵母菌純種培養(yǎng)的菌種發(fā)酵體系內(nèi)，四環(huán)素碎片較多，培養(yǎng)基中雜質(zhì)明顯多于混種培養(yǎng)體系。

2.2.2 菌渣發(fā)酵放罐時(shí)料液中的氨基酸含量分析

菌渣發(fā)酵后氨基酸的增長(zhǎng)是菌渣處理的關(guān)鍵指標(biāo)，氨基酸含量越高說明菌渣的處理效果越好，氨基酸的貢獻(xiàn)主要由酵母破壁后釋放得到，考察游離氨基酸含量即可分析判斷酵母生長(zhǎng)量及四環(huán)素菌渣的分解狀況。

如表3，發(fā)酵體系中接入黑曲霉發(fā)酵結(jié)束時(shí)氨基酸總和高于酵母純種培養(yǎng)時(shí)的40%以上，各種氨基酸釋放比較完全，氨基酸種類沒有減少，發(fā)酵料液氣味芳香。

2.2.3 發(fā)酵過程中的氨基氮變化規(guī)律

發(fā)酵過程的氨基氮變化規(guī)律表現(xiàn)了菌渣分解過程的動(dòng)態(tài)平衡，在黑曲霉和酵母混合培養(yǎng)體系中，發(fā)酵前期隨黑曲霉對(duì)大分子氮源的分解氨基氮逐漸升高，發(fā)酵中期酵母菌利用氮源繁殖生長(zhǎng)，氨基氮上升趨勢(shì)緩慢，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏，酵母菌自溶破壁，氨基酸大量釋放，氨基氮有明顯的上升趨勢(shì)。但在酵母菌純種培養(yǎng)體系內(nèi)，發(fā)酵前期氨基氮的增長(zhǎng)緩慢，大分子氮源分解利用速度較慢，發(fā)酵結(jié)束時(shí)氨基氮水平低于混種培養(yǎng)，酵母菌含量明顯少于混種培養(yǎng)。如圖1。

2.3 結(jié)論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黑曲霉在液體發(fā)酵過程中可以分泌蛋白酶和纖維素酶，在菌渣發(fā)酵體系中黑曲霉與酵母混合培養(yǎng)，黑曲霉產(chǎn)生的纖維素酶和蛋白酶分解菌渣中的大分子碳氮源，營(yíng)養(yǎng)物結(jié)構(gòu)發(fā)酵改變，可以促進(jìn)酵母菌的生長(zhǎng)。酵母菌在混合培養(yǎng)體系內(nèi)生長(zhǎng)速度較快，酵母含量高，酵母破壁后可以釋放大量的有機(jī)物，提高了菌渣二次發(fā)酵后的料液質(zhì)量。

從以上分析結(jié)果看，菌渣發(fā)酵采用黑曲霉和啤酒酵母混種發(fā)酵時(shí)，氨基酸含量和氨基氮含量明顯高于酵母純種發(fā)酵，抽樣檢查發(fā)酵料液中核苷酸含量也高于純種發(fā)酵。所以在菌渣發(fā)酵處理體系中引入黑曲霉混種發(fā)酵效果顯著，發(fā)酵料液質(zhì)量有明顯提高，菌渣處理比較徹底，發(fā)酵后固含量殘留減少，效果明顯。這種處理方式，能最大程度的減少固體菌渣排放，對(duì)環(huán)境的影響作用降到了最低。而且分解處理后產(chǎn)生的氨基酸類物質(zhì)，可循環(huán)利用作為氮源回用于發(fā)酵或做飼料，既減少了環(huán)境污染，又產(chǎn)生了新的效益和價(jià)值。

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