劉書晶， 吳彩娥， 范龔健， 李婷婷， 應(yīng)瑞峰

（南京林業(yè)大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，江蘇 南京 210037）

桑葚，俗稱桑果、烏葚和桑泡兒等，是桑科桑屬多年生木本植物桑樹的果實。我國桑葚資源豐富，已被國家衛(wèi)生部列為“既是食品又是藥品”的食品原料之一。桑葚不耐儲存，采收后極易變質(zhì)、失水，目前多被加工成桑葚果汁、桑葚酒和桑葚果醬等。桑葚酒是一種新興的果酒，營養(yǎng)價值高，富含花色苷、黃酮、白藜蘆醇等生物活性物質(zhì)而被廣泛研究[1]。目前已有關(guān)于桑葚酒發(fā)酵工藝優(yōu)化[2]和香氣成分分析[3]及發(fā)酵期間總花色苷的變化[4]的報道，但是還未見桑葚酒發(fā)酵期間花色苷種類和含量的變化規(guī)律研究。

隨著花色苷的抗氧化[5]、抗腫瘤[6]和預(yù)防糖尿病[7]等生理活性被相繼報道，花色苷越來越受到人們的關(guān)注。花色苷作為桑葚中的主要活性成分，對其加工產(chǎn)品的質(zhì)量表征具有重要意義。目前桑葚酒主要采用葡萄酒釀制中常用的活性釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，但不同原料的成分差別較大，采用葡萄酒專用釀酒酵母不能更好地突出桑葚自身的特色[8]。自然發(fā)酵在紅葡萄酒[9]和青梅酒[10]釀造中取得較好的效果。目前還未見桑葚酒自然發(fā)酵的研究報道。

為探明桑葚酒發(fā)酵期間花色苷和抗氧化活性的變化規(guī)律，作者通過測定發(fā)酵期間總酚、總花色苷和花色苷單體質(zhì)量濃度，游離、聚合和輔色花色苷的質(zhì)量濃度以及抗氧化活性等指標(biāo)，并采用主成分分析對其進(jìn)行綜合評價，有助于促進(jìn)桑葚酒優(yōu)質(zhì)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚：產(chǎn)自山東省濰坊市；1，1-二苯基-2-三硝基 苯 肼 （2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二 （3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-Azinobis -（3 -ethylbenzthiazoline -6 -sulphonate），ABTS）、矢車菊-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%），矢車菊-3-蕓香糖苷標(biāo)準(zhǔn)品 （純度≥98.0%）：美國 Sigma公司；三氟乙酸、乙腈（色譜純）：美國Tedia公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UVmini-1240型紫外分光光度計：日本島津公司；LHS-150HC-11型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TG16-WS型臺式高速離心機：長沙湘儀離心儀器有限公司；Waters2695液相色譜：美國Waters公司。

1.3 桑葚酒自然發(fā)酵

參照葡萄酒釀造工藝[11]制定了桑葚酒自然發(fā)酵的基本工藝。選擇成熟度高、無腐爛的新鮮桑葚，破碎、打漿，放入2.5 L發(fā)酵瓶中，每瓶裝2.0 kg桑葚（約2 L），調(diào)整SO2質(zhì)量濃度至70 mg/L，加蔗糖調(diào)整成分至可溶性固形物含量為20°Brix，在18℃恒溫箱中培養(yǎng)。主發(fā)酵期間每天對其進(jìn)行 “打帽”處理，并取樣測定相關(guān)指標(biāo)；主發(fā)酵結(jié)束后，過濾酒液，進(jìn)入后發(fā)酵，每隔3天測定相關(guān)指標(biāo)。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 總酚 參照Fan等[12]的方法略有改動，總酚質(zhì)量濃度以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，依據(jù)福林-肖卡法測定總酚。精確吸取離心后的桑葚酒200 μL，置于離心管中，加入已經(jīng)稀釋10倍的1.5 mL福林試劑，搖勻，加入1.5 mL質(zhì)量濃度為75 g/L的Na2CO3溶液，充分混勻，暗處靜置2 h，在紫外-可見分光光度計下，用10 mm比色皿，在725 nm波長下測定吸光值。結(jié)果以每毫升桑葚酒中含有相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù)表示。

1.4.2 抗氧化活性 采用DPPH和ABTS兩種體系測定桑葚酒自然發(fā)酵期間抗氧化活性的變化，參照楊道強等[13]的方法稍加改動。取200 μL稀釋后的樣品置于10 mL比色管中，加3 mL DPPH溶液，混勻靜置30 min，利用紫外-可見分光光度計，在517 nm測定吸光值。取200 μL稀釋后的樣品，加3 mL ABTS溶液，在暗室反應(yīng)30 min，利用紫外-可見分光光度計，在734 nm下測定吸光值。

以水溶性維生素E（Trolox）為參照物，結(jié)果以每毫升桑葚酒清除自由基能力相當(dāng)于Trolox清除同等自由基的毫克數(shù)。

1.4.3 總花色苷 取離心后的桑葚酒200 μL，加5mL酸化乙醇，避光靜置30 min，測定其530 nm處吸光度值，結(jié)果以矢車菊素-3-葡萄糖苷計[14]。

式中，MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量（449.2）；ε 為摩爾消光系數(shù) （ε=26 900）；DF 為稀釋倍數(shù)。

1.4.4 游離、輔色和聚合花色苷 參考Bimplias等[15]的方法略有改動，通過模擬酒（12%乙醇，5 g/L酒石酸，0.2 mol/L的NaCl，調(diào)整 pH值至 3.6）溶液將酒樣稀釋20倍，在520 nm處測定吸光值A(chǔ)wine。將20%乙醛40 μL加到4 mL的酒樣中，靜置45 min，在520 nm處測定待測液的吸光值A(chǔ)。將5%SO2320 μL加到4 mL的酒樣中，在520 nm處測定待測液的吸光值A(chǔ)SO2。

1.4.5 色澤評價 參考Bimplias等[15]的方法并加以改進(jìn)，未稀釋的桑葚酒樣品用1 mm比色皿分別在420、520、620 nm 處測定吸光值。

1.4.6 花色苷單體 桑葚酒過0.45 μm的濾膜，采用 XBridge-C18 柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），28 ℃進(jìn)行HPLC分離，紫外檢測器（Waters 2489）。進(jìn)液量為20 μL，洗脫液為體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸（A）和乙腈（B），流速為0.8 mL/min，梯度洗脫。檢測波長為520 nm，洗脫順序見表1。以矢車菊-3-葡萄糖苷和矢車菊-3-蕓香糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品，精確稱取花色苷單體標(biāo)準(zhǔn)品并配置成不同質(zhì)量濃度的花色苷單體標(biāo)準(zhǔn)溶液，在520 nm處檢測吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算花色苷單體質(zhì)量濃度。

表1 桑葚酒花色苷洗脫順序Table 1 Elution order of mulberrywine anthocyanins

1.5 數(shù)據(jù)分析

文中數(shù)據(jù)重復(fù)3次，結(jié)果以Mean±SD表示；用SPSS20.0進(jìn)行顯著性和主成分分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 桑葚酒發(fā)酵期間總酚質(zhì)量濃度的變化

如表2所示，桑葚酒發(fā)酵期間總酚質(zhì)量濃度變化差異顯著（P＜0.05），這與趙紅宇等[5]在桑葚全渣發(fā)酵過程中的結(jié)果一致，可能的原因是主發(fā)酵期間采用“打帽”方式，桑葚中的酚類物質(zhì)不斷溶出，導(dǎo)致桑葚酒總酚質(zhì)量濃度升高。發(fā)酵第10天后，總酚質(zhì)量濃度逐漸降低，至發(fā)酵終點變化趨于平緩，總酚質(zhì)量濃度變化差異不顯著（P＞0.05）。這可能是單寧類等物質(zhì)聚合、酚類物質(zhì)氧化作用、微生物產(chǎn)生的酶促使多酚類物質(zhì)發(fā)生降解，多酚類物質(zhì)的水溶性下降[16]，使桑葚酒中總酚的質(zhì)量濃度呈下降趨勢。此外，花色苷作為桑葚酒中主要的酚類物質(zhì)，其質(zhì)量濃度變化對桑葚酒總酚質(zhì)量濃度也有較大的影響。

2.2 桑葚酒發(fā)酵期間抗氧化活性的變化

桑葚酒發(fā)酵期間清除DPPH自由基能力呈先升高后降低的趨勢。桑葚酒在發(fā)酵第3天和第4天時清除DPPH自由基能力最大，比發(fā)酵起點和終點分別高0.79 mg/mL和0.54 mg/mL。桑葚酒發(fā)酵過程中，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，酒液中酚類物質(zhì)溶出加快，其清除DPPH自由基能力提高。發(fā)酵后期桑葚酒清除DPPH自由基能力下降，這可能是由于桑葚酒中酚類物質(zhì)受溫度和pH值的影響而發(fā)生聚合和氧化反應(yīng)[17]。此外，張曉松等[16]研究發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞壁在微生物酶的作用下釋放出蛋白質(zhì)、多糖等成分，在一定程度上也會影響DPPH的清除能力。桑葚酒發(fā)酵期間清除ABTS自由基能力變化不規(guī)律。ABTS法反映的清除ABTS自由基的能力可與任何羥基化的芳香族化合物反應(yīng)[18]，這就與DPPH法測定的抗氧化能力存在明顯差異[19]。

表2 桑葚酒自然發(fā)酵期間總酚質(zhì)量濃度及抗氧化活性變化Table 2 Changes of total phenolic content and antioxidant activity of mulberry wine during spontaneousfermentation

2.3 桑葚酒發(fā)酵期間總花色苷含量的變化

桑葚酒發(fā)酵期間總花色苷含量呈先升高后降低的趨勢，見表3。發(fā)酵第2天達(dá)到最高值（530.29 mg/L），這是可能由于發(fā)酵過程中乙醇浸提作用造成的。發(fā)酵結(jié)束時，桑葚酒總花色苷質(zhì)量濃度僅為最高點的32.87%。有研究表明，酵母在酒精發(fā)酵期間能產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶能水解花色苷的糖苷鍵，這是導(dǎo)致總花色苷質(zhì)量濃度下降的主要原因[14]。此外，酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生的丙酮酸和乙醛等小分子物質(zhì)能與花色苷發(fā)生聚合生成吡喃花色苷[6]，這也有可能導(dǎo)致桑葚酒總花色苷質(zhì)量濃度下降。

2.4 游離、輔色和聚合花色苷質(zhì)量濃度的變化

桑葚酒發(fā)酵期間游離花色苷、輔色花色苷和聚合花色苷的比例變化顯著。游離花色苷比例由87.53%下降到70.64%，輔色花色苷比例由9.70%下降到1.73%，聚合花色苷比例由3.63%增加到27.66%。韓富亮等[20]在對紅葡萄酒的研究中發(fā)現(xiàn)，葡萄中的聚合花色苷雖然很少，但在發(fā)酵期間可促進(jìn)聚合花色苷的形成，利于葡萄酒顏色的形成。桑葚酒發(fā)酵期間游離、輔色和聚合花色苷質(zhì)量濃度的變化也體現(xiàn)了這一變化規(guī)律。

2.5 桑葚酒發(fā)酵期間色澤的變化

如表3所示，在整個發(fā)酵期間色度呈下降趨勢，在發(fā)酵第14天達(dá)到最低值，為0.47，后發(fā)酵期間，色度趨于穩(wěn)定。這表明桑葚酒發(fā)酵前期，顯色物質(zhì)的總量在減少，而發(fā)酵后期顯色物質(zhì)趨于穩(wěn)定，這與發(fā)酵酒液中花色苷等呈色物質(zhì)的消長規(guī)律有關(guān)[21]。一般花色苷質(zhì)量濃度越高，酒顏色越深，色度越高[22]。色調(diào)的變化趨勢與色度相反。色調(diào)反映各顏色之間的變化、轉(zhuǎn)移情況。發(fā)酵過程中，色度的變化會對色調(diào)產(chǎn)生影響[21]。桑葚酒發(fā)酵過程中色調(diào)不斷增加，說明酒液中顯現(xiàn)黃色物質(zhì)增加（A420）而顯現(xiàn)紅色物質(zhì)減少（A520），這與李甜等[23]對紫薯酒發(fā)酵過程顏色變化規(guī)律的研究結(jié)果類似。

2.6 桑葚酒發(fā)酵期間花色苷單體比例的變化

經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，桑葚酒中主要存在兩種花色苷單體，見圖1，其出峰時間與標(biāo)準(zhǔn)品矢車菊-3-葡萄糖苷和矢車菊-3-蕓香糖苷一致。陳亮等[24]也證實了桑葚花色苷主要為矢車菊-3-葡萄糖苷和矢車菊-3-蕓香糖苷。桑葚酒發(fā)酵過程中，矢車菊-3-葡萄糖苷和矢車菊-3-蕓香糖苷質(zhì)量濃度呈下降趨勢，比初始發(fā)酵液（第0天）分別下降了86.84%和72.17%。何英霞等[11]研究認(rèn)為，酵母在生長繁殖過程中會產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，該酶能將花色苷水解為花青素，而花青素在水溶液中穩(wěn)定性差，易降解。此外，兩種花色苷單體在發(fā)酵過程中降解速率存在較大差異，這是由于矢車菊-3-蕓香糖苷的結(jié)構(gòu)比矢車菊-3-葡萄糖苷復(fù)雜，極性小，不易受到水分子的攻擊導(dǎo)致[6]。

圖1 桑葚酒花色苷液相圖譜Fig.1 HPLC chromatogram ofanthocyanins inmulberrywine

2.7 相關(guān)性分析

對桑葚酒自然發(fā)酵期間的11項指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析和顯著性檢驗，見表4）?？偦ㄉ召|(zhì)量濃度與游離花色苷比例、色度、矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-蕓香糖糖苷質(zhì)量濃度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與聚合花色苷比例、色調(diào)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），聚合花色苷的比例與桑葚酒的色調(diào)有極顯著的正相關(guān)性（P＜0.01），與色度有顯著的負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），說明花色苷的質(zhì)量濃度和種類決定了桑葚酒的顏色性質(zhì)；桑葚酒清除DPPH自由基能力與總酚質(zhì)量濃度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），說明酚類物質(zhì)是桑葚酒中的主要抗氧化成分。

表3 桑葚酒自然發(fā)酵期間花色苷及色澤變化Table 3 Changes of anthocyanins and color of mulberry wine during spontaneous fermentation

表4 桑葚酒自然發(fā)酵期間各指標(biāo)相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysisof each index of mulberry wine during spontaneous fermentation

2.8 主成分分析

主成分分析是利用降維思想，通過描述性統(tǒng)計、差異性檢驗以及發(fā)酵過程的得分圖、載荷圖，把多個指標(biāo)轉(zhuǎn)化成少數(shù)幾個相互獨立且包含原來指標(biāo)大部分信息的綜合指標(biāo)，通過研究指標(biāo)體系的內(nèi)在結(jié)構(gòu)關(guān)系，使結(jié)果更具有客觀性和準(zhǔn)確性[25]。本研究中第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分別包含了原來信息量的61.77%和22.81%，為了以盡可能少的指標(biāo)反映盡量多的信息，選取前兩個因子作主成分，代表桑葚酒自然發(fā)酵主要的指標(biāo)，見圖2。

圖2 不同成分因子載荷散點圖Fig.2 Loadings plot of principal component analysis of different constituents

PC1主要綜合了總花色苷、輔色花色苷、聚合花色苷、游離花色苷、色度、色調(diào)、矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-蕓香糖苷的信息，其中聚合花色苷、色調(diào)在PC1上呈負(fù)向分布，其他呈正向分布，即在PC1坐標(biāo)正向，PC1越大，聚合花色苷、色調(diào)取值則越小。PC2主要綜合了總酚、DPPH、ABTS的信息，其中總酚、DPPH在第二主成分上呈負(fù)向分布，ABTS呈正向分布。變量與原點的距離反映其因子載荷，位于坐標(biāo)軸原點遠(yuǎn)端的變量具有較大的因子載荷，位于原點近端的變量具有較小的因子載荷[25]。結(jié)合載荷散點圖看，發(fā)酵第0天具有最大的因子載荷，含有較高的生物活性物質(zhì)，清除DPPH、ABTS自由基的能力也顯著，抗氧化活性高。發(fā)酵第8～10天聚為一類，生物活性物質(zhì)含量低，抗氧化活性低。發(fā)酵第14-20天含有較高的總酚、清除DPPH、ABTS自由基的能力顯著，見圖3。利用主成分分析基本上反映了發(fā)酵期間桑葚酒花色苷質(zhì)量濃度、色澤和抗氧化活性的貢獻(xiàn)率，有效地揭示桑葚酒發(fā)酵期間花色苷、色澤和抗氧化活性的內(nèi)在關(guān)系。

圖3 桑葚酒公因子得分圖Fig.3 Common scores scatter plot of mulberry wine

3 結(jié) 語

作者研究了桑葚酒自然發(fā)酵期間花色苷、色澤及抗氧化活性變化，并對結(jié)果進(jìn)行了相關(guān)性和主成分分析，獲得以下主要結(jié)論：桑葚酒發(fā)酵期間花色苷、色澤以及抗氧化活性等指標(biāo)變化顯著；酚類物質(zhì)是桑葚酒中主要抗氧化成分，桑葚酒的色澤與花色苷的種類和質(zhì)量濃度密切相關(guān)；對桑葚酒發(fā)酵期間的各指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，提取得到兩個主成分，其中PC1主要綜合了桑葚酒的色澤以及花色苷組成與質(zhì)量濃度相關(guān)信息，反映了桑葚酒發(fā)酵期間花色苷與色澤之間的變化規(guī)律；PC2主要綜合了總酚質(zhì)量濃度及抗氧化活性的相關(guān)信息，反映了桑葚酒發(fā)酵期間酚類物質(zhì)抗氧化活性的變化規(guī)律。利用主成分分析有效地揭示桑葚酒發(fā)酵期間花色苷、色澤及抗氧化活性的變化規(guī)律，為更進(jìn)一步開發(fā)高品質(zhì)的桑葚酒提供了可行途徑。