金其貫 張奧英 劉瑜 徐廣艷 張瑜

1揚州大學體育學院（揚州 225127）

2玉溪師范學院（玉溪 653100）

肝臟是機體進行糖代謝，維持血糖穩(wěn)定的主要器官[1，2]。當肝臟葡萄糖輸出過多，不能被其他器官有效利用時，血糖升高，出現(xiàn)胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和2型糖尿病[3]。肝臟IR主要是指胰島素抑制肝臟葡萄糖生成（hepatic glucose production，HGP）的能力下降，胰島素抑制內源性葡萄糖生成的作用減弱和肝糖原合成減少是其主要特征。一旦高分泌的胰島素也無法代償，就會使空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）升高[4]，是肥胖引起糖尿病、非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）等代謝綜合征的主要發(fā)病機制。HGP增加來自糖異生和糖原分解兩個方面，而糖異生的速度取決于葡萄糖6磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G-6-Pase）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）這2種關鍵酶轉錄的多少[4]。而磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）是胰島素在肝臟發(fā)揮生理效應的主要信號轉導通路，叉頭轉錄因子1（forkhead transcription factor 1，F(xiàn)oxO1）是PI3K/Akt信號的下游分子，是胰島素活性的重要靶點，主要通過調控G-6-Pase和PEPCK的表達促進空腹時肝臟糖異生，增加HGP[5，6]。因此，F(xiàn)oxO1表達紊亂可以損傷胰島素調節(jié)肝臟糖脂代謝的能力[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食（high-fat diet，HFD）引起的肥胖大鼠出現(xiàn)肝細胞膜、肌肉細胞膜和脂肪細胞膜胰島素受體結合力顯著下降以及高胰島素血癥等IR的特征，而進行8周的耐力性運動干預后，肝細胞膜、肌肉細胞膜和脂肪細胞膜的胰島素受體結合力均顯著提高，血胰島素水平顯著下降，IR得到改善[8]。但有研究對NAFLD進行16周的運動干預后發(fā)現(xiàn)，運動鍛煉有效地減少了NAFLD患者肝臟脂肪含量，改善了外周IR，但不足以改善肝臟IR[9]。因此，并不是所有個體都能得到運動提高胰島素敏感性的預期效果，這些人被認為是運動抵抗。熱量限制是一種提高運動增強外周和肝臟的胰島素敏感性效應的方法，在運動后限制碳水化合物的攝入可對提高外周胰島素的敏感性提供相加的效應[10]。24周的飲食和身體活動生活方式干預可降低慢性丙型肝炎肥胖患者的肝臟胰島素抵抗[11]。而魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）是魔芋的主要成分，能減少和延緩葡萄糖的吸收，具有良好的減肥、降脂、降糖和潤腸通便的作用[12]。但是，目前KGM以及KGM聯(lián)合有氧運動對肝臟IR的干預作用及其交互作用尚未見到研究報道。本研究通過對SD大鼠喂飼HFD誘導肝IR形成的同時進行有氧運動和/或補充KGM，觀察肝臟PI3K/Akt/FoxO1及肝臟糖異生酶（G-6-Pase和PEPCK）的變化，探討有氧運動或/和KGM對HFD大鼠肝臟IR形成的干預作用及其機制。

1 對象和方法

1.1 動物分組及實驗方案

雄性SD大鼠50只，體重160～180 g，購于浙江省實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）20080033。分籠飼養(yǎng)，每籠5只，室溫20±2℃，光照12 h左右。大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組（NC組，n=10）、HFD對照組（HFC組，n=10）、HFD+KGM組（HFK，n=10）、HFD+運動組（HFE，n=10）、HFD+運動+KGM組（HFEK，n=10）5組。在實驗期間，NC組大鼠喂飼普通飼料，HFC、HFE、HFK和HFEK組喂飼高脂飼料，高脂飼料按照66.5%普通飼料、20%蔗糖、10%豬油、2%豬膽酸鹽和1.5%膽固醇的配方由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場加工制作。HFK和HFEK組每天以50 mg/kg體重的劑量灌服KGM，KGM購于合肥博美生物科技有限公司。HFE和HFEK組每天晚上進行60 min的無負重游泳運動訓練，每周6次，共持續(xù)10周。游泳池為100 cm×70 cm×60 cm內壁光滑的塑料水桶，水深50 cm以上，水溫32±1℃。實驗過程中，由于操作不當，HEK組有1只大鼠死亡。

1.2 實驗取材

動物在末次運動鍛煉結束后的第二天上午取材，在取材前禁食8 h，依次按50 mg/kg的劑量腹腔注射2%的戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉，然后從腹主動脈抽取血液5 ml注入采血管中，放置1 h后離心（4000 rpmin，10 min）分離血清，在2 h內測定空腹血糖（FPG），其余保存于-40℃冰箱中，以備測胰島素等指標。并取出部分肝組織，用錫箔紙包裹后放入液氮中速凍，并移入-40℃冰箱中保存，測試前用冰生理鹽水制備成10%的組織勻漿，經(jīng)4000 r/min離心10 min后，分離上清液用于測定PI3K、Akt、FoxO1、PEPCK、G-6-Pase蛋白含量。

1.3 指標的測定

FPG采用葡萄糖氧化酶法測定，測定儀器為日立全自動生化分析儀。血清FINS和肝組織PI3K、Akt、FoxO1、PEPCK、G-6-Pase蛋白含量采用ELISA測定，試劑盒購于美國R&B公司，測定儀器為ELX800型酶標儀，并根據(jù)公式FPG×FINS／22.5計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）。肝組織勻漿的總蛋白定量采用考馬斯亮蘭法，試劑盒購于南京建成生物研究所，測試儀器為722型紫外分光光度計。

1.4 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理，結果用平均值 ±標準差表示。NC組和HFC組之間采用獨立樣本t檢驗，HFC、HFK、HFE和HFEK組之間采用雙因素方差分析，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

2 結果

2.1 各組大鼠肝臟PEPCK、G-6-Psae蛋白含量的變化

由表1、2可見，與NC組相比，HFC組肝臟PEPCK和G-6-Pase含量極顯著性升高（P＜0.01）；通過雙因素方差分析可知，有氧運動和KGM可顯著降低HFD大鼠肝臟PEPCK（P＜0.05，P＜0.01）和G-6-Pase（P＜0.01）含量；有氧運動聯(lián)合KGM對降低HFD大鼠肝臟PEPCK和G-6-Pase含量有顯著性的交互作用（P＜0.01，P＜0.05）。

表1 各組大鼠PEPCK、G-6-Pase含量的變化

2.2 各組大鼠FPG、FINS和HOMA-IR的變化

由表3、4可見，與NC組相比，HF組大鼠FPG、FINS含量以及HOMA-IR極顯著性升高（P＜0.01）；通過雙因素方差分析可知，有氧運動和KGM均可降低HFD大鼠FPG（P＜0.05）、FINS水平（P＜0.01）和 HOMA-IR（P＜0.01），而有氧運動聯(lián)合KGM雖然對降低HFD大鼠FPG水平無顯著性交互作用（P＞0.05），但對降低FINS含量和HOMA-IR具有顯著性的交互作用（P＜0.01，P＜0.05）。

表3 各組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR水平的變化

表4 各組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR的雙因素方差分析

2.3 各組大鼠肝臟PI3K、Akt、FoxO1蛋白含量的變化

由表5、6可見，與NC組相比，HFC組大鼠肝臟PI3K含量極顯著性降低（P＜0.01），Akt和FoxO1含量極顯著性升高（P＜0.01）；通過雙因素方差分析可知，有氧運動雖然不能顯著性降低HFD大鼠肝臟Akt含量（P＞0.05），但能顯著性升高PI3K含量（P＜0.01）、顯著性降低FoxO1含量（P＜0.05）；KGM補充雖然不能顯著性升高HFD大鼠肝臟PI3K含量（P＞0.05），但可極顯著性降低Akt和FoxO1含量（P＜0.01）；有氧運動聯(lián)合KGM雖對降低Akt含量無顯著性的交互作用（P＞0.05），但對升高PI3K和降低FoxO1含量有顯著性交互作用（P＜0.05）。

表5 各組大鼠PI3K、Akt、FoxO1含量的變化

表6 各組大鼠PI3K、Akt和FoxO1的雙因素方差分析

3 分析與討論

研究證實，高血脂尤其是游離脂肪酸（FFA）和甘油三酯（TG）的升高是導致IR的重要原因[13]。大量脂肪的攝入會引起脂肪、肌肉和肝臟組織產(chǎn)生IR，導致胰島素抑制內源性葡萄糖生成的機制受損。由于HFD引起的IR動物模型和人類肥胖引起的IR相似，故不少學者給正常大鼠喂飼HFD成功復制了肝臟IR動物模型[14，15]。目前，HGP的測量是評估肝臟IR的最普遍的方法[16]，但其檢測方法比較繁瑣。由于HGP增加是增加肝臟葡萄糖輸出的基礎，而肝糖異生的增多是最主要的途徑。PEPCK和G-6-Pase是決定著肝臟糖異生速度的兩個關鍵酶，而且HOMA-IR與肝臟IR有良好的相關性（r=0.64）[17]，是評價肝臟IR的指標之一。因此，本研究通過測定肝臟PEPCK和G-6-Pase的變化，結合HOMA-IR來評估肝臟IR的形成。結果發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，HFC組大鼠肝臟PEPCK、G-6-Pase含量非常顯著性升高（P＜0.01）的同時，F(xiàn)PG、FINS以及HOMA-IR均非常顯著性升高（P＜0.01），從而說明10周的HFD可以引起大鼠肝臟IR的形成。

胰島素是通過激活PI3K/Akt信號通路而發(fā)揮作用的，PI3K、Akt活性和（或）表達缺陷可能參與IR和2型糖尿病的發(fā)生[18-20]。FoxO1和Foxa2是肝臟監(jiān)測血液中胰島素水平與糖脂代謝的傳感器（sensor）[5]。胰島素通過激活PI3K/Akt信號轉導通路，使FoxO1磷酸化，導致FoxO1失去轉錄活性，從而抑制G-6-Pase及PEPCK基因表達，促進空腹時肝臟糖異生，增加肝糖輸出[21，22]。KKAy糖尿病小鼠肝臟和肌肉FoxO1的表達顯著高于對照組[23，24]。肝臟中FoxO1過度表達時糖耐量出現(xiàn)損傷，肝臟糖原和脂肪沉積水平降低；而FoxO1功能喪失時肝臟糖異生的功能受到抑制，此時胰島素敏感性增加，葡萄糖利用增強。無論是HFD誘導的肥胖小鼠還是糖尿病db/db鼠肝臟中FoxO1轉錄活性均明顯增加，從而上調過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1β（PGC-1β）、乙酰CoA羧化酶及脂肪酸合成酶的表達。因此，F(xiàn)oxO1有整合胰島素信號和線粒體的功能，F(xiàn)oxO1表達紊亂可以損傷胰島素調節(jié)肝臟糖脂代謝的能力[7]，阻斷FoxO1能改善IR和代謝綜合癥患者的肝糖脂代謝[25]。肝臟胰島素信號傳導途徑的缺陷可能對糖異生抑制不足，導致空腹和飯后高血糖癥。為了探討HFD誘導大鼠肝臟IR形成的機制，本研究通過給大鼠喂飼HFD，10周后在測定肝臟組織中G-6-Pase和PEPCK含量的同時，測定了肝組織中PI3K、Akt和FoxO1的含量。結果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，HFC組大鼠肝組織中PI3K含量極顯著性地降低（P＜0.01），Akt、FoxO1含量顯著升高（P＜0.01）。從而進一步說明PI3K/Akt/FoxO1信號通路在HFD誘導的大鼠肝臟IR形成中發(fā)揮了非常重要的作用，即長期的HFD可能降低了肝臟胰島素敏感性，抑制了PI3K活性，從而使FoxO1水平增加，刺激肝臟糖異生，增加肝臟內源性葡萄糖的生成，促進肝臟IR的形成。然而，本研究中PI3K和Akt的變化卻出現(xiàn)了不一致的情況，其原因可能是長期的HFD降低了肝臟中PI3K活性，使Akt的磷酸化（p-Akt）減少，從而導致非磷酸化的Akt含量增加。因此，在研究肝臟的胰島素傳導通路時，要檢測Akt和p-Akt的水平，才能完整分析清楚其傳導過程及其機制。

有氧運動和飲食控制是預防和治療IR和2型糖尿病的基本措施。正常動物或2型糖尿病人即使在一次急性運動后胰島素抑制肝臟葡萄糖生成的能力就會得到顯著提高[26，27]。而12周的運動訓練聯(lián)合低熱量飲食可以使2型糖尿病病人肝臟胰島素的敏感性顯著提高27%，基礎內源性葡糖糖的生成顯著減少17%[28]。在不受飲食干預影響的條件下，運動可減少NAFLD患者肝細胞內甘油三酯含量，但是控制飲食聯(lián)合運動比單獨運動更加有效[29]。通過增加高蛋白質/低碳水化合物飲食的消耗來限制能量的攝入可特異性降低肝內甘油三酯含量[30]。而KGM是一種天然的膳食纖維，不易被消化吸收，熱量極低，易溶于水，可以吸收自身體積100倍的水，具有極強的吸水膨脹性，增加飽腹感，且在胃腸道中能與膽固醇結合，促進其排泄增多[31]，并能降低小腸粘膜Na+-K+-ATP酶活性，抑制腸道的吸收功能，延遲葡萄糖的吸收[32]，從而改善2型糖尿病患者糖代謝紊亂狀態(tài)，使 FPG和餐后血糖下降[33]。因此，KGM可以減少糖和脂肪的攝入，減少脂肪在肝組織中的沉積，改善組織對胰島素的敏感性，調節(jié)糖脂代謝，是預防和治療IR、脂肪肝、糖尿病等代謝綜合征發(fā)生和發(fā)展的良好方法[12]。然而，補充KGM能否改善肝臟IR以及補充KGM聯(lián)合運動能否產(chǎn)生協(xié)同效應，目前尚未見到研究報道。本研究在給大鼠喂飼HFD誘導肝臟IR形成的同時，分別進行運動訓練和/或補充KGM。通過雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)，有氧運動和KGM可顯著降低HFD大鼠肝臟PEPCK（P＜0.05，P＜0.01）和G-6-Pase（P＜0.01）含量、FPG（P＜0.05）、FINS水平（P＜0.01）和HOMA-IR（P＜0.01）；有氧運動聯(lián)合KGM雖然對降低HFD大鼠FPG水平無顯著性交互作用（P＞0.05），但對降低HFD大鼠肝臟PEPCK、G-6-Pase、FINS含量和HOMA-IR有顯著性的交互作用（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05）。從而說明有氧運動和補充KGM可以有效改善HFD大鼠胰島素抑制肝臟糖異生的能力，減少HGP，降低FPG，從而有效地預防HFD大鼠肝臟IR的形成，且有氧運動聯(lián)合KGM的干預效果比單純進行有氧運動鍛煉或KGM干預效果更好。

有關有氧運動或補充KGM對肝臟IR的干預機制目前還不完全清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動可能通過調節(jié)或減少脂肪在肝臟中的沉積增強肝臟胰島素的作用[34]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，4個月的抗阻訓練可以顯著增強老年女子胰島素抑制內源性葡萄糖生成（EGP）的能力，但是不能改變肝臟和內臟脂肪對葡糖糖的攝取以及異位脂肪的數(shù)量[35]。而有氧運動可以通過激活PI3K/Akt通路改善機體對胰島素的反應性[36]。高脂飲食致IR大鼠肝組織中的Akt蛋白表達顯著降低，而6周游泳運動干預可顯著提高IR大鼠肝組織中Akt蛋白的表達水平[37]。在2小時的耐力性游泳運動8小時后，在空腹條件下肥胖和糖尿病鼠肝臟中胰島素信號轉導顯著改善，胰島素刺激的Akt和Foxo1磷酸化顯著增加，HNF-4α蛋白水平顯著降低，伴隨著糖異生基因PEPCK和G-6-Pase表達的顯著降低，PI3K抑制劑LY292004可逆轉運動對空腹高血糖癥的急性作用，從而說明Foxo1和HNF-4α活性的調節(jié)是運動鍛煉改善IR狀態(tài)下葡萄糖穩(wěn)態(tài)的重要機制[38]。而肝臟胰島素作用的喪失與肥胖癥條件下促炎生物分子的產(chǎn)生有關。TRB3蛋白能夠抑制Akt活性并因此維持肝細胞核中的FoxO1活性，誘導高血糖癥。而體育鍛煉可以通過減少炎癥過程，抑制TRB3的產(chǎn)生，抑制糖異生來改善肝臟IR[39]。而且運動鍛煉可以降低肥胖小鼠肝臟中絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-3（MKP-3）和FoxO1/MKP-3關聯(lián)表達，并能減少FoxO1磷酸化以及過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1-α（PGC-1α）和糖異生酶（PEPCK和G6Pase）的蛋白水平[40]。為了探討PI3K/Akt/FoxO1信號通路在有氧運動和KGM補充干預HFD大鼠肝臟IR形成中的作用，本研究在大鼠喂飼HFD的同時，進行60 min、每周6次的有氧運動鍛煉和/或補充KGM，通過雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)，有氧運動可使HFD大鼠肝臟Akt含量無顯著性降低（P＞0.05），但可使PI3K含量顯著性升高（P＜0.01）、FoxO1含量顯著性降低（P＜0.05）；KGM可使HFD大鼠肝臟PI3K含量無顯著性升高（P＞0.05），但可使Akt和FoxO1含量極顯著性降低（P＜0.01）；有氧運動聯(lián)合KGM雖對降低Akt含量無顯著性的交互作用（P＞0.05），但對升高PI3K和降低FoxO1含量有顯著性交互作用（P＜0.05）。從而說明長期的有氧運動或補充KGM能夠改善HFD大鼠肝臟PI3K含量，進而降低FoxO1的蛋白含量來抑制肝臟的糖異生能力，減少肝糖的生成，有效地預防肝臟IR的發(fā)生。但是，肝臟中Akt仍出現(xiàn)與PI3K不一致的現(xiàn)象，我們推測可能是由于長期的有氧運動鍛煉或補充KGM有效地提高了肝組織中PI3K活性，導致p-Akt生成增多，從而導致非磷酸化的Akt含量減少，其確切機制還有待于進一步研究。因此。長期的有氧運動和補充KGM可以增加脂肪的氧化和抑制脂肪的吸收，從而降低脂肪在肝臟的沉積，增加肝細胞對胰島素的敏感性，改善HFD大鼠肝臟的胰島素信號傳導路徑，增強胰島素對肝臟糖異生的抑制能力，降低HGP，對有效預防肝臟IR和2型糖尿病的發(fā)生具有非常重要的作用。

4 結論

（1）長期的高脂膳食可以抑制肝臟PI3K/FoxO1信號通路，增加肝糖異生，誘導肝臟胰島素抵抗的形成。

（2）有氧運動或補充魔芋葡甘聚糖可以通過改善肝臟PI3K/FoxO1信號通路，抑制肝糖異生，有效預防高脂膳食大鼠肝臟胰島素抵抗的形成，維持空腹血糖的穩(wěn)定。而且，魔芋葡甘聚糖的補充在一定程度上對有氧運動預防高脂膳食大鼠肝臟胰島素抵抗的形成具有附加作用。