劉娜 王琪蕾 陳凌云

【摘 要】 目的：用高效液相色譜測(cè)定脂質(zhì)體中克班寧的含量。方法：色譜柱采用Diamonsil C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-0.008%三乙胺水=75∶25為流動(dòng)相，流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。結(jié)果：克班寧在0.06～1.8mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，克班寧平均回收率為101.56%，RSD為6.77%。結(jié)論：本方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，適用于測(cè)定脂質(zhì)體中克班寧的含量，便于質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜；脂質(zhì)體；克班寧

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2018）14-0022-03

Abstract：Objective To study the determination method of Crebanine in liposome using HPLC. Methods The separation was performed on a Diamonsil C18 column（4.6mm×250mm， 5μm）， The mobile phase was composed of methanol-（0.008%）triethylamine solution （75∶25， V/V）， flow rate of 1.0mL/min， column temperature of 30℃， the detection wavelength of 280nm.Results Crebanine has a good linear relationship in 0.06～ 1.8mg/mL the linear range， the average recovery rate was 101.56%，RSD was 6.77%. Conclusion The method is simple， accurate， reproducible and suitable for the determination of the content of Crebanine in liposomes， easy quality control.

Keywords：HPLC； Liposome； Crebanine

克班寧（Crebanine，Cre）是由防己科千金藤屬植物“山烏龜”中提取得到的異喹啉類阿樸菲型生物堿。前期研究發(fā)現(xiàn)[1-2]其具有較強(qiáng)的心血管藥理活性，對(duì)多種實(shí)驗(yàn)性心律失常具有較強(qiáng)的對(duì)抗作用，且起效迅速，維持時(shí)間較短，是值得深入研究開發(fā)的生物活性物質(zhì)。由于前期研究[3-5]已發(fā)現(xiàn)克班寧具顯著活性的同時(shí)也有較明顯的毒性，故研究將克班寧制成脂質(zhì)體，使其毒性降低，安全有效地發(fā)揮其抗心律失常作用。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC方法測(cè)定脂質(zhì)體中克班寧的含量，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，為克班寧脂質(zhì)體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀（自動(dòng)進(jìn)樣器、二級(jí)管陣列檢測(cè)器、恒溫柱溫箱）， C18色譜柱（Diamonsil C18， 4.6mm×250mm，5μm）； 電子天平（Sartorius BT 25s），SK 250 HP 超聲清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 材料 克班寧對(duì)照品（自制[6]）；大豆磷脂（批號(hào)：20140202，上海太偉藥業(yè)有限公司）；膽固醇（批號(hào)：20110708，中國(guó)新興化工試劑研究所）；克班寧脂質(zhì)體屬于自制；甲醇、三乙胺等流動(dòng)相所用試劑均為色譜純，其余均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 克班寧脂質(zhì)體的制備 采用逆向蒸發(fā)法制備空白脂質(zhì)體，處方按照大豆卵磷脂、膽固醇質(zhì)量比5∶1，并用適量氯仿溶解，加入量取一定量的pH為3的檸檬酸水溶液，超聲混勻成W/O型乳劑，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上30℃恒溫水浴減壓蒸發(fā)除去氯仿，得空白脂質(zhì)體混懸液。以藥值比1∶4取適量鹽酸克班寧與空白脂質(zhì)體混合均勻并用Na2HPO4調(diào)pH至5.8，50℃恒溫水浴20min，即得克班寧脂質(zhì)體。

2.2 樣品溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取克班寧（含量94.1%）0.3g置100mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取“2.1”項(xiàng)下克班寧脂質(zhì)體1mL置10mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，作為供試品。

2.2.3 陰性對(duì)照品溶液 精密稱取卵磷脂3.3mg，膽固醇0.67mg置10mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即為陰性對(duì)照品。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Diamonsil C18（ 4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.008%三乙胺水（75∶25）；流速為1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm。

在上述色譜條件下，取克班寧標(biāo)準(zhǔn)品，克班寧脂質(zhì)體供試品及陰性對(duì)照品，分別取10μL注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。系統(tǒng)適應(yīng)性測(cè)定結(jié)果（見表1）。克班寧的分離度大于9.10，理論塔板數(shù)按克班寧計(jì)算不少于5000，克班寧的拖尾因子為1.08。結(jié)果表明：樣品中克班寧的色譜峰分離度、拖尾因子均能滿足《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥD高效液相色譜法項(xiàng)下規(guī)定，理論板數(shù)按克班寧計(jì)算均大于5000，因此該色譜條件適合于克班寧脂質(zhì)體的分析，色譜圖如圖1所示。

2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2”項(xiàng)下克班寧對(duì)照品，依次精密吸取0.1、0.2、0.4、0.5、1、2、3mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于5mL的容量瓶中加甲醇定容，即得濃度為0.06、0.12、0.24、0.30、0.60、1.20、1.80mg/mL的克班寧系列標(biāo)準(zhǔn)品。分別精密吸取克班寧系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10μL注入液相色譜儀，照上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。結(jié)果克班寧的回歸方程為A= 1839.6C-604.65 （r=0.999），線性范圍為0.06～1.8mg；表明克班寧在線性范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液各10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，結(jié)果峰面積的RSD為0.007924%，小于3%，結(jié)果表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，在0、2、4、6、8h分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD值是0.024333%，小于3%，所以標(biāo)準(zhǔn)品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次供試品6份，按照“2.2”項(xiàng)下方法，分別精密量取1mL，用甲醇定容于10mL容量瓶中，分別經(jīng)微孔濾膜（0.45μm），過濾后再分別進(jìn)樣10μL，結(jié)果6份樣品的平均RSD是0.303%小于5%，表明本法具有較好的重現(xiàn)性。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)品精取3mL分別用甲醇定容于10mL、50mL、100mL的容量瓶中，配得高（881.1μg/mL），中（440.55μg/mL），低（88.11μg/mL）克班寧對(duì)照溶液，分別取克班寧對(duì)照低、中濃度和高濃度各2mL置于10mL容量瓶中，再分別加入克班寧脂質(zhì)體樣品（2.81mg/mL）3mL于容量瓶，用甲醇定容，搖勻，經(jīng)微孔濾膜（0.4μm）過濾后再分別取10μL注入液相色譜儀，照該品含量測(cè)定方法，測(cè)定含量，計(jì)算平均回收率為101.56%，RSD值為6.77%。表明本實(shí)驗(yàn)回收良好。見表2。

2.9 樣品測(cè)定 取克班寧脂質(zhì)體4批，依上述HPLC法測(cè)定克班寧脂質(zhì)體中克班寧含量，每份樣品測(cè)定兩次，結(jié)果4批樣品平均含量的53.95%，為后期研究工作提供研究方法。

3 討論

脂質(zhì)體作為新型藥物輸送系統(tǒng)，具有類細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能使藥物延長(zhǎng)藥效、改變被包封藥物的體內(nèi)分布，提高藥物的治療指數(shù)，減少藥物的治療劑量和降低毒性。而克班寧毒性大、在動(dòng)物體內(nèi)為超速處置類（t1/2<1h）藥物，利用脂質(zhì)體作為輸送介質(zhì)，達(dá)到延長(zhǎng)藥效和降低毒性的目的。為后期克班寧在抗心律失常的應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究。采用HPLC對(duì)克班寧脂質(zhì)體進(jìn)行含量測(cè)定，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于克班寧納米脂質(zhì)體的質(zhì)量控制。在實(shí)驗(yàn)中，參照文獻(xiàn)[7]流動(dòng)相比例進(jìn)行含量測(cè)定，而因脂質(zhì)體膜材料即卵磷脂和膽固醇的影響，最終以甲醇-0.008%三乙胺水比例是75∶25能得到理想的分離效果。為克班寧脂質(zhì)體的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-05-16 編輯：程鵬飛）