王志景 馬麗麗 程珂 王慧 何全中 孫力

作者單位：453003 新鄉(xiāng) 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居女性惡性腫瘤第四位［1］，已嚴(yán)重威脅女性健康［2-3］。宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素、多步驟的復(fù)雜過程，與環(huán)境因素以及HPV持續(xù)反復(fù)感染關(guān)系密切［2］。早期盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是患者復(fù)發(fā)、死亡的主要原因，闡明其轉(zhuǎn)移和浸潤機(jī)制意義重大。研究表明，miR-502在結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［3-5］，但在宮頸癌中的作用尚不明確。本研究通過數(shù)據(jù)庫分析miR-502在宮頸癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系，并通過宮頸癌Hela細(xì)胞探討miR-502對(duì)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響，以期為闡明其轉(zhuǎn)移和增殖機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

宮頸癌Hela細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海），胎牛血清和RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基購自Hyclone公司，青-鏈霉素雙抗、0.25%胰酶購自博士德生物工程有限公司，CCK-8試劑盒購自碧云天生物科技有限公司，miR-502-3p類似物、miR-502-3p抑制劑及陰性對(duì)照購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，Transwell小室購自Milipore公司，倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡均為日本Nikon公司生產(chǎn)。

1.2 數(shù)據(jù)庫分析

通過數(shù)據(jù)庫（http：//www.linkedomics.org/）［6］分析miR-502與宮頸癌患者總體生存率及TNM分期的關(guān)系。首先選擇腫瘤類型為宮頸癌；其次選擇研究數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)類型為miRNASeq，平臺(tái)為HS miR；第三步輸入has-mir-502；第四步目標(biāo)數(shù)據(jù)集選擇“臨床”；第五步選擇非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

宮頸癌Hela細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素及0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞鋪滿80%左右傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞鋪滿80%左右轉(zhuǎn)染。使用前將Lipofectamine 2000試劑與miR-502-3p類似物、miR-502-3p抑制劑或陰性對(duì)照混勻，室溫孵育5 min。將6孔板培養(yǎng)基吸出，用不含抗生素、無血清培養(yǎng)基洗滌2次，加入2 mL無抗生素培養(yǎng)基，每孔逐滴加入miR-502-3p類似物（miR-502-3p類似物組）、miR-502-3p抑制劑（miR-502-3p抑制劑組）或陰性對(duì)照（陰性對(duì)照組）與Lipofectamine 2000試劑150 μL，混合物終濃度為100 nmol/L。在37℃、5%CO2中孵育24 h后更換培養(yǎng)基。

1.4 CCK-8法檢測(cè)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖能力

轉(zhuǎn)染24 h后，將miR-502-3p類似物組、miR-502-3p抑制劑組和陰性對(duì)照組約2×103個(gè)細(xì)胞種植于96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，孵育2 h，在 450 nm 波長處測(cè)定吸光度（OD值），細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌Hela細(xì)胞遷移及侵襲能力

轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞用0.25%胰酶消化，將約106個(gè)細(xì)胞種植于上層小室，下層小室放置含10%胎牛血清培養(yǎng)基。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃培養(yǎng)24 h，取出下層小室，吸干培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次，Gemisa溶液染色5 min，在高倍鏡下（10×40）隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞，取平均數(shù)。以陰性對(duì)照組為100%，計(jì)算各組細(xì)胞的遷移率。細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)需提前用基質(zhì)膠將下層小室包被24 h，其他步驟同細(xì)胞遷移能力檢測(cè)方法。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)庫分析中總生存率采用Kaplan-Meier法，組間差異行Log-rank檢驗(yàn)；不同TNM分期宮頸癌患者miR-502表達(dá)量采用非參數(shù)檢驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高表達(dá)miR-502的宮頸癌患者整體預(yù)后較好

數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，miR-502表達(dá)量高于中位數(shù)（3.58）的宮頸癌患者總生存時(shí)間更長（P=0.005），見圖1A；在不同宮頸癌TNM分期患者中miR-502表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.27，0.61，0.08），見圖1B～D。

圖1 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果

2.2 過表達(dá)miR-502-3p可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48h后，miR-502-3p類似物組細(xì)胞增殖率為（78.82±1.41）%，miR-502-3p抑制劑組的細(xì)胞增殖率為（124.06±7.72）%。以陰性對(duì)照組為100%，miR-502-3p類似物組細(xì)胞增殖率明顯下降，miR-502-3p抑制劑組細(xì)胞增殖率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 過表達(dá)miR-502-3p可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞遷移和侵襲

Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-502-3p類似物組細(xì)胞遷移率和侵襲率分別為（85.39±7.19）%和（85.32±7.12）%；miR-502-3p抑制劑組分別為（121.17±8.20）%和（117.13±7.37）%。以陰性對(duì)照組細(xì)胞遷移率和侵襲率為100%，miR-503-3p類似物組細(xì)胞遷移率和侵襲率下降（P<0.05）；而miR-502-3p抑制劑組細(xì)胞遷移率和侵襲率升高（P<0.0.5）。

3 討論

miR-502在多種惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在肝癌研究中發(fā)現(xiàn)miR-502在體內(nèi)外均能明顯抑制細(xì)胞增殖，可能通過抑制磷酸肌醇3-激酶催化亞基γ發(fā)揮作用［7］。而在食管癌中抑制miR-502表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［8］。Zhai等［3］在結(jié)直腸癌研究中亦發(fā)現(xiàn)miR-502可抑制細(xì)胞在體內(nèi)外增殖。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-502在乳腺癌增殖、轉(zhuǎn)移、浸潤和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用［9］。本研究通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miR-502的宮頸癌患者總生存時(shí)間更長，不同腫瘤TNM分期患者其表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合以上研究，提示miR-502可能作為抑癌基因而在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，推測(cè)miR-502在宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中亦可能發(fā)揮作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

miR-502-3p是miR-502的成熟體，在腫瘤研究中應(yīng)用廣泛［10］。為進(jìn)一步研究miR-502對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的影響，本研究選擇miR-502-3p作為miR-502的成熟體，首先采用人工合成的miR-502-3p類似物、miR-502-3p抑制劑及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞，采用CCK-8和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染miR-502-3p對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-502-3p類似物后，宮頸癌Hela細(xì)胞增殖速度較轉(zhuǎn)染miR-502-3p抑制劑明顯降低，且遷移和侵襲能力明顯下降。與Jin等［10］研究發(fā)現(xiàn)miR-502-3p可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲結(jié)果相似。說明過表達(dá)miR-502-3p能抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，而前期數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果高表達(dá)miR-502宮頸癌患者預(yù)后較好，亦可能與其抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。但本研究?jī)H在細(xì)胞系體外功能實(shí)驗(yàn)中觀察過表達(dá)或抑制miR-502-3p表達(dá)時(shí)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移情況，通過何種途徑發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。