江帆，郭穎，李郢慧，杜雙奎，王杏利，王華

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)圖書館，陜西 楊凌 712100； 3.渭南市食品執(zhí)法監(jiān)察支隊(duì)，陜西 渭南 714000)

黑豆是我國(guó)珍稀的優(yōu)異糧油作物資源，除含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素及異黃酮、強(qiáng)心苷等功能因子，還含有大量的抗氧化性物質(zhì)[1,2]。陳醋具有抗疲勞、調(diào)節(jié)血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化等多種生理功能[3]。醋泡黑豆集合了黑豆和陳醋的營(yíng)養(yǎng)和保健作用，據(jù)報(bào)道，醋泡黑豆具有美容、減肥、補(bǔ)腎、明目、烏發(fā)功能，可有效改善便秘、高血壓、高血脂、腰酸腿痛、糖尿病、慢性疲勞、寒癥、高膽固醇、冠心病等[4，5]。近年來(lái)，醋泡黑豆作為一種功能性保健食品已風(fēng)靡日本。隨著黑豆中的有效成分被不斷地分離提取出來(lái)，其特有的功能性質(zhì)引起了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[6-8]。而民間醋泡黑豆大多屬于作坊式生產(chǎn)，其制備條件和功能特性變化尚不明確。因此，優(yōu)化醋泡黑豆的制備條件，開展其功能特性探究具有重要意義。本研究以黑豆和陳醋為試驗(yàn)材料，采用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化醋泡黑豆制備工藝條件，以期為醋泡黑豆產(chǎn)品的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

東北黑豆：購(gòu)于遼寧省開原市鉅富商貿(mào)有限公司；山西陳醋：總酸≥3.6 g/dL，購(gòu)于山西來(lái)福老陳醋股份有限公司；沒(méi)食子酸、蘆丁、兒茶素：購(gòu)于Sigma公司；福林-酚(Folin-Ciocalteu)試劑：購(gòu)于上海喜潤(rùn)化學(xué)工業(yè)有限公司；1,1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)、Fe3+-三吡啶三吖嗪(TPTZ)、其他試劑等：均為分析純級(jí)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠； FW 100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；UV mini 1240單孔紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；HH-S4 A型恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；KDC-40 低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑豆的預(yù)處理

將黑豆分選、清洗、瀝干后為生黑豆樣品。將生黑豆樣品用水泡制過(guò)夜后煮制20 min，冷卻至室溫，瀝干水分即為熟黑豆樣品。

1.3.2 加醋浸泡

將準(zhǔn)備好的生、熟黑豆樣品放入玻璃罐中，分別按試驗(yàn)設(shè)計(jì)比例加陳醋泡制，玻璃罐密封后分別置于室溫和0～4 ℃冰箱中，泡制2，5，7，14天后，分別取出醋泡黑豆樣品進(jìn)行分析。

1.3.3 樣品處理

將泡制好的黑豆樣品取出，在30 ℃干燥16 h，隨后用高速粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，收集篩下物，4 ℃保存?zhèn)溆梅治觥?/p>

1.3.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別以黑豆與陳醋的比例、浸泡溫度和浸泡天數(shù)為試驗(yàn)因素，設(shè)置不同的水平進(jìn)行單因素試驗(yàn)。黑豆與陳醋的比例設(shè)置為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，浸泡溫度為室溫(24～27 ℃)和2～4 ℃；浸泡時(shí)間：熟黑豆設(shè)置為2，10，12，14，16天，生黑豆設(shè)置為5，7，9，11，13，15，17天。以總酚含量、總黃酮含量和DPPH·清除率為指標(biāo)衡量抗氧化性。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L16(42×29)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化制備條件，因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5 分析測(cè)定

1.3.5.1 提取液的制備

稱取2.00 g黑豆粉，用25 mL 70%丙酮25 ℃條件下在振蕩器中振蕩提取3 h，3800 r/min離心10 min，收集上清液。殘留物用70%丙酮再提取3 h，離心，合并提取液，定容至50 mL，冷藏保存，備用。

1.3.5.2 總酚含量的測(cè)定

采用福林-酚(Folin-Ciocalteu)法測(cè)定[9]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：準(zhǔn)確稱取0.1 g沒(méi)食子酸，用蒸餾水定容至100 mL，再吸取此溶液2 mL，定容至50 mL，使得溶液濃度為0.04 mg/mL。分別取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8，2.1，2.4 mL于一組10 mL容量瓶中，各加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混合。隨后各加入2.5 mL 20% Na2CO3混合，并用蒸餾水定容，室溫避光靜置2 h，測(cè)其在765 nm下的吸光度，以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，A765值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y=0.0959x+0.0401(R2=0.9996)。總酚含量以每1 g提取物(干基)中所含相當(dāng)于沒(méi)食子酸的量表示。

樣品測(cè)定：取1 mL樣品提取液，按照上述步驟測(cè)定樣品中總酚含量。每一試樣重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.5.3 總黃酮含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：準(zhǔn)確稱取0.05 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇定容至50 mL，搖勻，再吸取此溶液10 mL于50 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇定容，充分混勻，使得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為0.2 mg/mL，備用。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL于一組10 mL容量瓶中，加30%乙醇至5 mL，之后加入0.3 mL 5% NaNO2，搖勻，靜置5 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3，搖勻，靜置6 min，然后加入4 mL 4% NaOH，用蒸餾水定容，搖勻并靜置15 min，在510 nm下測(cè)定吸光值，以溶劑做空白，繪制吸光度與蘆丁濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y=12.582x+0.0007(R2=0.9994)?？傸S酮含量以每1 g提取物(干基)中所含相當(dāng)于蘆丁的量表示。

樣品測(cè)定：取1 mL樣品提取液，按照上述步驟測(cè)定樣品中總黃酮的含量。每一試樣重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.5.4 DPPH·清除率測(cè)定

取1.0 mL樣品提取液，加入2 mL 2×10-4mol/L DPPH和4.0 mL無(wú)水乙醇，充分混合，室溫下避光靜置30 min，以無(wú)水乙醇做空白，于517 nm下測(cè)定吸光度。計(jì)算樣品提取液對(duì)DPPH·的清除率：

式中：A0為用無(wú)水乙醇代替樣品液時(shí)的吸光度；A1為加樣品與DPPH時(shí)的吸光度；A2為用無(wú)水乙醇代替DPPH時(shí)的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆與陳醋的比例對(duì)醋泡黑豆品質(zhì)的影響

以不同比例陳醋在2～4 ℃下浸泡熟黑豆8天，醋泡黑豆的總酚、總黃酮含量及DPPH·清除率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 黑豆與陳醋的比例對(duì)醋泡黑豆品質(zhì)的影響Table 2 The effect of the ratio of black beans and mature vinegar on the quality of vinegar soaked black beans

由表2可知，黑豆與陳醋的比例對(duì)醋泡黑豆的抗氧化特性有影響。在黑豆與陳醋的比例為1∶3時(shí)，醋泡黑豆的總酚含量達(dá)到最大(2.174 mg/g)，總黃酮含量隨著浸泡醋比例的增加呈先降低后升高的趨勢(shì)，在黑豆與陳醋比為1∶4時(shí)含量最高(1.913 mg/g)。與未處理黑豆相比，醋泡黑豆的總酚含量、總黃酮含量有所降低。未經(jīng)處理的生黑豆DPPH·清除率為64.27%，醋泡后清除效果顯著提高，均在90%以上。

2.2 浸泡溫度對(duì)醋泡黑豆品質(zhì)的影響

以黑豆與陳醋的比例為1∶3，在室溫為2～4 ℃下浸泡熟黑豆2天，其總酚、總黃酮含量及DPPH·清除率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 浸泡溫度對(duì)醋泡黑豆品質(zhì)的影響Table 3 The effect of the soaking temperature on the quality of vinegar soaked black beans

由表3可知，在2～4 ℃下制備的醋泡黑豆的總酚和總黃酮含量明顯高于室溫處理。醋泡黑豆的總酚和總黃酮含量低于熟黑豆的總酚和總黃酮含量(2.89，2.31 mg/g)。2～4 ℃下制備的醋泡黑豆與室溫的DPPH·清除率兩者差異不大，但均高于原黑豆(82.03%)。

2.3 浸泡時(shí)間對(duì)醋泡黑豆品質(zhì)的影響

當(dāng)黑豆與陳醋的比例為1∶4、室溫下浸泡黑豆時(shí)，醋泡黑豆的總酚、總黃酮含量及DPPH·清除率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 浸泡時(shí)間對(duì)醋泡黑豆品質(zhì)的影響Table 4 The effect of the soaking time on the quality of vinegar soaked black beans

由表4可知，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，醋泡黑豆的總酚、總黃酮含量呈先升高后下降的趨勢(shì)，總酚和總黃酮含量均在第9天達(dá)最大(2.726，2.311 mg/g)。這與黑豆浸泡初期浸吸陳醋導(dǎo)致總酚、總黃酮含量增大有關(guān)；當(dāng)浸吸達(dá)到飽和后，黑豆皮中的總酚、總黃酮含量會(huì)隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而溶出到陳醋中，從而導(dǎo)致抗氧化物質(zhì)含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。DPPH·清除率并未隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)規(guī)律變化，醋泡后黑豆的DPPH·清除效果顯著提高，均高于原黑豆。

2.4 醋泡黑豆制備條件的優(yōu)化

以總酚、總黃酮為試驗(yàn)指標(biāo)，以浸泡時(shí)間、黑豆與陳醋比例、浸泡溫度、黑豆生熟為試驗(yàn)因素，L16(42×29)正交試驗(yàn)方案及分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 L16(42×29)正交試驗(yàn)方案及總酚、總黃酮測(cè)定結(jié)果Table 5 Orthogonal experimental scheme of L16(42×29) and test results of total phenols and total flavonoids

續(xù) 表

由表5極差分析可知，影響醋泡黑豆中總酚含量、總黃酮含量的因素主次順序?yàn)镈>C>A>B，即黑豆生熟影響最大，是主要因素，浸泡溫度影響次之，浸泡時(shí)間、黑豆與醋的比例影響最小。進(jìn)一步方差分析結(jié)果表明(見(jiàn)表6)，黑豆生熟對(duì)醋泡黑豆總酚含量、總黃酮含量的影響達(dá)到極顯著(p=0.0004，p=0)，浸泡溫度對(duì)總酚含量的影響顯著(p=0.0184)，對(duì)總黃酮含量的影響極顯著(p=0.005)，而浸泡時(shí)間、黑豆與陳醋的比例對(duì)總酚含量、總黃酮含量的影響均不顯著(p>0.05)。從總酚角度分析，優(yōu)化組合為A1B3C2D1，即以生黑豆為原料，按黑豆與陳醋的比例為1∶4在2～4 ℃下浸泡2天即可獲得高總酚含量的醋泡黑豆；由總黃酮角度分析，優(yōu)化組合為A2B3C2D1，即選取生黑豆為原料，按黑豆與陳醋比為1∶4在2～4 ℃條件下浸泡7天，醋泡黑豆具有高總黃酮含量。

表6 方差分析結(jié)果Table 6 Results of variance analysis

對(duì)生黑豆、熟黑豆、正交試驗(yàn)16個(gè)組合的醋泡黑豆DPPH·清除作用進(jìn)行比較，見(jiàn)圖1。

圖1 不同條件下醋豆的DPPH·清除作用Fig.1 DPPH· scavenging activities of vinegar soaked black beans under different conditions

經(jīng)陳醋浸泡過(guò)的黑豆，其DPPH·清除率均明顯提高，與原始黑豆相比，清除率由原來(lái)的64.27%，78.56%增加到88%以上。表明陳醋浸泡過(guò)的黑豆，其抗氧化特性明顯增強(qiáng)。

依據(jù)醋泡黑豆總酚含量分析，優(yōu)化泡制條件為以生黑豆為原料，按黑豆與陳醋為1∶4在2～4 ℃條件下浸泡2天?？偡拥谋Ａ袈蔬_(dá)到83.89%，總酚含量比生黑豆降低了16.11%；依據(jù)總黃酮含量分析，優(yōu)化浸泡條件為以生黑豆為原料，按黑豆與陳醋比為1∶4在2～4 ℃條件下浸泡7天?？傸S酮含量比生黑豆降低了5.18%，這與陳芬等人報(bào)道的醋浸能導(dǎo)致大豆總黃酮含量降低的結(jié)果相一致[10]。這可能與在陳醋浸泡過(guò)程中總黃酮水解，部分溶解在醋液中有關(guān)。綜合考慮，浸泡2天的生黑豆中依然含有相對(duì)較高的抗?fàn)I養(yǎng)因子，故確定生黑豆與陳醋按1∶4混合在2～4 ℃下浸泡7天為適宜浸泡條件。此時(shí)總酚含量為6.568 mg/g，總黃酮含量為6.619 mg/g?？偡?、總黃酮相比原黑豆降低了16.77%，5.18%，依然有較高的保留率(83.23%，94.82%)。

3 結(jié)論

醋泡黑豆制備條件對(duì)醋泡黑豆的抗氧化特性有顯著影響。黑豆生熟、浸泡溫度對(duì)醋泡黑豆總酚、總黃酮含量的影響顯著或極顯著，浸泡時(shí)間、黑豆與陳醋的比例的影響不顯著。優(yōu)化制備條件為生黑豆與陳醋按1∶4混合在2～4 ℃下浸泡7天，總酚含量為6.568 mg/g，總黃酮含量為6.619 mg/g，具有較高的抗氧化特性。