羅瀟，呂嘉栃，于鑫

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安 710021)

泡菜作為微生物發(fā)酵蔬菜制品，含有豐富的益生菌，具有“新鮮、清香、嫩脆、味美”的特點(diǎn)[1,2]，并且解膩開胃，促消化，增食欲[3]，是一種健康食品，受到人們的歡迎。國(guó)內(nèi)外研究表明，植物經(jīng)過(guò)多種微生物發(fā)酵后能改善其風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并且含有豐富的酶類、維生素C、β-胡蘿卜素，產(chǎn)生能夠清除ABTS、DPPH自由基，具有還原力的物質(zhì)，有一定的抗氧化能力[4-10]。人工接種微生物發(fā)酵蔬菜的抗氧化活性表現(xiàn)出濃度依賴性，隨著添加物料的量和品種的增加而增高[11]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)作為其中主要的功效酶之一，在抗衰老、預(yù)防和治療心腦血管等疾病方面具有明顯效果[12]，但目前對(duì)泡菜中SOD酶活性的研究較少。

本研究從底物濃度、溫度、pH、金屬離子4個(gè)方面研究SOD酶的性質(zhì)，并通過(guò)最大波長(zhǎng)的掃描、改變鄰苯三酚溶液濃度、改變樣液添加量確定了國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)SOD酶活性的最佳條件，最后研究了不同條件下發(fā)酵過(guò)程中SOD酶活性的變化，為制備出具有高SOD酶活的泡菜提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白菜、山藥、西紅柿、冬瓜、胡蘿卜、油麥菜、芹菜、黃瓜：陜西西安華潤(rùn)萬(wàn)家超市；保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumparlactis)：陜西科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室；焦性沒食子酸(分析純)、乙二胺四乙酸二鈉(分析純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；SOD酶(色譜純)：上海源葉生物科技有限公司；酚酞(分析純)：西安化學(xué)試劑采購(gòu)站；氫氧化鈉(分析純)：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(分析純)：深圳市碳拓科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DM750型LEICA數(shù)碼顯微鏡 北京瑞科中儀科技有限公司；PHS-3C型pH計(jì) 北京賽多利斯天平有限公司；QSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申電醫(yī)療器械廠；JY-502型電子天平 上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；YC-26L型醫(yī)用冷藏冰箱 中科美菱低溫科技有限公司；SW-DJ-1D型單人超凈工作臺(tái) 蘇州凈化儀器有限公司；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HWS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；UV-2600型紫外分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 SOD酶性質(zhì)研究

1.3.1.1 底物濃度對(duì)SOD酶活性的影響

將底物鄰苯三酚的濃度分別配制成2.5，3.0，3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5，8.0 mmol/L。按照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定》[13]的方法測(cè)得鄰苯三酚氧化速率，得到米氏方程曲線。并取雙倒數(shù)作圖，計(jì)算出此條件下SOD的Km值，分析底物濃度對(duì)SOD酶活性的影響。

1.3.1.2 溫度對(duì)SOD酶活性的影響

取SOD酶標(biāo)品3 mg，用100 mL蒸餾水稀釋，配制成待測(cè)酶液。取1 mL酶液和反應(yīng)底物分別在20，25，37，42 ℃保溫，每隔10 min用鄰苯三酚氧化法測(cè)定SOD酶活性。

1.3.1.3 pH值對(duì)SOD酶活性的影響

取pH值分別為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，7.0，8.0緩沖液加入酶液，37 ℃水浴鍋保溫2 h，用鄰苯三酚氧化法測(cè)定SOD酶活性。

1.3.1.4 金屬離子對(duì)SOD酶活性的影響

在SOD標(biāo)準(zhǔn)品中分別加入CuSO4、ZnSO4、FeSO4和MnSO4溶液，使得酶液中金屬離子的最終濃度梯度為0.01,0.03,0.05,0.1,0.3,0.5,1.0 mmol/L，充分混勻后靜置1 h，用鄰苯三酚氧化法測(cè)定SOD酶活性。

1.3.2 SOD酶檢測(cè)方法的研究

1.3.2.1 鄰苯三酚自氧化最大波長(zhǎng)的選擇

按照國(guó)標(biāo)配制4.5 mmol/L的鄰苯三酚溶液，對(duì)鄰苯三酚自氧化過(guò)程依次隔5,10,15,20,25,30 min進(jìn)行光譜掃描，掃描波長(zhǎng)范圍為250～600 nm。

1.3.2.2 鄰苯三酚自氧化最佳濃度的確定

保證其他條件不變，分別配制1.0,2.5,3.0,4.5,7.0,8.5,10 mmol/L的鄰苯三酚溶液，測(cè)定自氧化速率。

1.3.2.3 最佳樣液添加量的選擇

保證其他條件不變，將樣液添加量分別設(shè)為10,20,50,100,150，200 μL，測(cè)定樣品對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的抑制率。

1.3.3 泡菜工藝流程

鹽水

↓

7種蔬菜→清洗、切分→晾干→裝壇→發(fā)酵→成品。

↑

菌種

1.3.4 操作要點(diǎn)[14]

蔬菜：挑選色澤正常、成熟度高、無(wú)霉變、無(wú)蟲蛀、無(wú)損傷的新鮮原料。

清洗、切分：將原料清洗干凈、切分成長(zhǎng)、寬、高為8 cm×1.5 cm×1.5 cm的長(zhǎng)方體。

晾干：切好的蔬菜瀝去水分，于陰涼處晾干。

菌種：將菌粉以1%的接種量接種到已滅菌的裝有MRS液體培養(yǎng)基的厭氧管中，37 ℃培養(yǎng)48 h，鏡檢無(wú)雜菌后轉(zhuǎn)接到下一批MRS培養(yǎng)基中?；罨?代作為接種菌液備用[15]。

發(fā)酵：將活化后的益生菌接入泡菜壇，在試驗(yàn)設(shè)定的接種量和溫度條件下發(fā)酵7天。

1.3.5 泡菜發(fā)酵過(guò)程中影響SOD酶活性的研究[16]

1.3.5.1 接種量的影響

確定溫度為25 ℃，裝料量為70%，自然pH下，分別按裝料量的5%,10%,15%,20%,30%體積接入等比例混合的5種菌進(jìn)行發(fā)酵，分別于1，2，3，4，5，6，7天進(jìn)行取樣，并測(cè)定SOD酶活性。

1.3.5.2 裝料量的影響

確定溫度為25 ℃，接種量為裝料量的20%，自然pH下，裝料量分別設(shè)定為50%,60%,70%,80%發(fā)酵混合蔬菜，分別于1,2,3,4,5,6，7天進(jìn)行取樣，并測(cè)定SOD酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOD酶性質(zhì)研究

2.1.1 底物濃度對(duì)SOD酶活性的影響

為了研究底物濃度對(duì)SOD酶活性的影響，將底物鄰苯三酚的濃度分別配制成2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5，8.0 mmol/L。按照國(guó)標(biāo)的方法測(cè)得鄰苯三酚自氧化的速率，得到米氏方程曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on enzyme reaction rate

由圖1可知，當(dāng)鄰苯三酚濃度很小時(shí)，SOD未被底物飽和，這時(shí)的反應(yīng)速率取決于鄰苯三酚的濃度，隨著鄰苯三酚濃度的增大，中間復(fù)合產(chǎn)物生成液越多，所以反應(yīng)速率隨之增高，當(dāng)鄰苯三酚濃度相當(dāng)高時(shí)，溶液中的SOD完全被底物飽和，沒有多余的酶，所以酶反應(yīng)速率趨于穩(wěn)定。將米氏方程橫縱坐標(biāo)取倒數(shù)，即Linewwaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，得到SOD酶的Km值為3.57×10-3mol/L，即當(dāng)酶反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底物濃度為3.57 mmol/L。

2.1.2 溫度對(duì)SOD酶活性的影響

為了研究溫度對(duì)SOD酶活性的影響，將底物和酶液分別在20，25，37，42 ℃保溫，每隔10 min分別用鄰苯三酚氧化法和黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD酶活性，結(jié)果見圖2。

圖2 不同溫度下SOD酶活性Fig.2 SOD activity at different temperatures

由圖2可知，SOD酶活性隨溫度變化顯著，隨著保溫時(shí)間的增長(zhǎng)，在不同溫度下SOD酶活性呈波動(dòng)性變化。保溫75 min、20 ℃條件下，SOD活力與初始值相比下降19%左右，達(dá)到184.19 U/mL；25 ℃條件下，SOD活力為150 U/mL，與初始值相比基本沒變；37 ℃條件下SOD活力為136.76 U/mL，與初始值相比有顯著增長(zhǎng)趨勢(shì)，增大了88.23 U/mL；42 ℃條件下SOD活力為93.75 U/mL，與初始值相比下降了46%。綜上所述，得知溫度為37 ℃時(shí)SOD活力顯著增大，25 ℃時(shí)SOD活力相對(duì)穩(wěn)定，保持不變。

2.1.3 pH值對(duì)SOD酶活性的影響

為了研究pH值對(duì)SOD酶活性的影響，取pH值分別為2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,7.0，8.0緩沖液加入酶液，2 h后用鄰苯三酚氧化法和黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD酶活性，結(jié)果見圖3。

圖3 不同pH值下SOD酶活性Fig.3 Determination of SOD activity at different pH values

由圖3可知，pH值對(duì)SOD酶活性影響顯著，隨著pH值的增大，SOD酶活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，可知pH值過(guò)低或者過(guò)高都會(huì)抑制SOD酶活性，當(dāng)pH為5.0時(shí)SOD酶活性達(dá)到最大,為131.11 U/mL，pH值保持在4.0～6.0所測(cè)得的SOD酶活性相對(duì)穩(wěn)定。

2.1.4 金屬離子對(duì)SOD酶活性的影響

為了研究金屬離子對(duì)SOD酶活性的影響，在SOD酶液中分別加入CuSO4、ZnSO4、FeSO4和MnSO4溶液，使得酶液中金屬離子的最終濃度梯度為0.01,0.03,0.05,0.1,0.3,0.5,1.0 mmol/L，充分混勻后靜置1 h，用鄰苯三酚氧化法和黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD酶活性，結(jié)果見圖4。

圖4 不同金屬離子濃度下SOD酶活性Fig.4 Determination of SOD activity atdifferent content of metal ions

由圖4可知，金屬離子濃度對(duì)SOD酶活性影響不同，不同濃度的Zn2+、Cu2+和Mn2+對(duì)SOD酶活性影響較小，SOD酶活性基本保持不變，但是Fe2+對(duì)SOD有明顯的抑制作用，隨著Fe2+濃度不斷增大，SOD酶活性逐漸降低，當(dāng)濃度大于0.5 mmol/L時(shí)SOD全部失活。

2.2 SOD酶檢測(cè)方法的研究

2.2.1 鄰苯三酚自氧化最大波長(zhǎng)的選擇

鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在特定波長(zhǎng)處有靈敏吸收峰，但在具體應(yīng)用中，測(cè)定波長(zhǎng)的選擇存在較大爭(zhēng)議，主要是選擇最大吸收峰是420 nm還是325 nm，為了準(zhǔn)確測(cè)定其最大吸收峰位置，本試驗(yàn)配制4.5 mmol/L的鄰苯三酚溶液，對(duì)鄰苯三酚自氧化過(guò)程依次隔5,10,15,20,25,30 min進(jìn)行光譜掃描，掃描波長(zhǎng)范圍為250～600 nm，其結(jié)果見圖5。

圖5 鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在不同時(shí)間掃描的吸收光譜Fig.5 Absorption spectra of pyrogallol autoxidation products scanned at different time

由圖5可知，在反應(yīng)一開始時(shí)即在320 nm處出現(xiàn)了最大吸收峰，420 nm處基本無(wú)吸收峰出現(xiàn)。隨自氧化反應(yīng)的不斷進(jìn)行，反應(yīng)中間產(chǎn)物不斷積累，320 nm處峰的吸收強(qiáng)度不斷增加。而420 nm處一直沒有觀測(cè)到有峰出現(xiàn)。文獻(xiàn)報(bào)道的最大吸收峰為420 nm和325 nm并不準(zhǔn)確?？紤]到峰的靈敏性和準(zhǔn)確性問題，本試驗(yàn)均選擇在波長(zhǎng)為320 nm處進(jìn)行測(cè)定。

2.2.2 鄰苯三酚自氧化最佳濃度的確定

鄰苯三酚濃度可對(duì)其自氧化產(chǎn)物的濃度產(chǎn)生影響，從而影響吸收信號(hào)的強(qiáng)度，因此，固定其他條件不變，僅改變鄰苯三酚的濃度，測(cè)定其對(duì)自氧化速率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 不同濃度鄰苯三酚自氧化速率Fig.6 Different concentration of pyrogallol autoxidation rate

由圖6可知，隨著鄰苯三酚濃度的增大，自氧化速率也隨著增大，兩者呈線性關(guān)系，線性方程為△A/min-1=0.015c-0.0015(R2=0.999)。結(jié)果說(shuō)明在鄰苯三酚濃度為4.5 mmol/L時(shí)，鄰苯三酚自氧化的曲線斜率約為0.06～0.07，基本滿足國(guó)標(biāo)要求，因此在后面試驗(yàn)中均選用鄰苯三酚的濃度為4.5 mmol/L。

2.2.3 最佳樣品添加量的選擇

用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD酶活性時(shí)，不同的樣品添加量對(duì)鄰苯三酚自氧化的抑制率不同，間接影響了所得到的SOD酶活性，因此固定其他條件不變，僅改變樣品加樣量，測(cè)定其對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的抑制率，結(jié)果見圖7。

圖7 不同樣液添加量對(duì)鄰苯三酚自氧化的抑制率Fig.7 Inhibition rate of pyrogallol autoxidation with different sample additive amount

由圖7可知，不同的樣品添加量對(duì)鄰苯三酚自氧化的抑制率不同，隨著樣品添加量的增加，抑制率也在增加，但是當(dāng)樣品添加量為100 μL時(shí)，鄰苯三酚自氧化抑制率為89%；再繼續(xù)增加樣品添加量為150 μL，鄰苯三酚自氧化抑制率增加緩慢，為94%；當(dāng)樣品添加量增加到200 μL時(shí)，抑制率為97%。說(shuō)明反應(yīng)體系中加入的鄰苯三酚含量是固定的，通過(guò)不斷地增加樣品添加量可以有效地抑制鄰苯三酚自氧化，但并不是樣品添加量越多越好。

2.3 接種量及裝料量對(duì)泡菜發(fā)酵中SOD酶活性的影響

通過(guò)改變接種量，在發(fā)酵7天的周期內(nèi)檢測(cè)SOD酶活性的變化，結(jié)果見圖8。

圖8 接種量對(duì)泡菜發(fā)酵過(guò)程中SOD酶活性的影響Fig.8 Effect of inoculum size on SOD enzyme activity during the fermentation of pickle

由圖8可知，不同的接種量發(fā)酵均可以產(chǎn)生SOD酶，SOD酶活性的變化不穩(wěn)定，整體隨發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)呈先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)。在25 ℃下不同的接種量之間SOD酶的活性差異顯著，其中接種量為20%在發(fā)酵第5天達(dá)到最大值95.75 U/mL，其次是接種量為30%的在發(fā)酵第5天時(shí)SOD酶活性為84.25 U/mL，其次是接種量為15%的在發(fā)酵第5天達(dá)到71.92 U/mL。直到發(fā)酵第7天結(jié)束時(shí)SOD酶降低到0～26.35 U/mL之間，基本與初始值相當(dāng)。

2.4 裝料量對(duì)SOD酶活性的影響

通過(guò)改變裝樣量，在發(fā)酵7天的周期內(nèi)檢測(cè)SOD酶活性的變化，結(jié)果見圖9。

圖9 裝料量對(duì)泡菜發(fā)酵過(guò)程中SOD酶活性的影響Fig.9 Effect of loading quantity on SOD enzyme activity during the fermentation of pickle

由圖9可知，不同的樣品裝樣量隨發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)呈先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)。其中裝樣量為50%與80%的發(fā)酵液中SOD酶活性較低；裝樣量為60%的發(fā)酵液中SOD酶活性在發(fā)酵第5天達(dá)到最大值101.52 U/mL，發(fā)酵后期有所降低；其次是裝樣量為70%的發(fā)酵液在發(fā)酵第4天SOD酶活性達(dá)到88.95 U/mL，后期下降明顯。

3 結(jié)論

本研究從底物濃度、溫度、pH、金屬離子4個(gè)方面研究了SOD酶的性質(zhì)，并通過(guò)鄰苯三酚自氧化最大波長(zhǎng)的掃描、改變鄰苯三酚溶液濃度、改變樣液添加量確定了國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)SOD酶活性的最佳條件，最后研究了接種發(fā)酵泡菜中接種量與裝料量對(duì)SOD酶活性的影響。結(jié)果表明：溫度為25℃、pH在4.0～6.0之間時(shí)SOD酶活性較高且穩(wěn)定，F(xiàn)e2+濃度過(guò)高時(shí)，SOD酶活性較低甚至失活；鄰苯三酚自氧化法檢測(cè)SOD酶活性的最佳條件為波長(zhǎng)320 nm、鄰苯三酚濃度4.5 mmol/L；接種量為20%、裝料量為70%時(shí)接種發(fā)酵泡菜中SOD酶活性較高。本研究為制備出具有高SOD酶活的泡菜提供了理論依據(jù)。