向敏 胡修忠 程蕾

摘要：為了制定有效的奶牛乳房炎防制措施，從病原菌分離、鑒定、耐藥性研究等方面，調(diào)查了奶牛乳房炎病原菌的流行病學(xué)和耐藥性，并研究了奶牛乳房炎的疫苗防控措施。細(xì)菌鑒定表明，導(dǎo)致奶牛乳房炎的病原菌主要為葡萄球菌和鏈球菌，占87.1%（54/62）；其次是各類桿菌占12.9%（8/62）。藥敏試驗顯示多數(shù)病原菌對3種以上的乳房炎常用藥物具有耐藥性。

關(guān)鍵詞：奶牛乳房炎；病原菌；耐藥性；防控措施

中圖分類號：S823.9+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）12-0085-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.12.023

Abstract： In this study，we investigated the epidemic situation and drug resistance of cow mastitis pathogens. The following aspects were contained：isolation，identification and drug sensitive test of pathogenic bactcria of cow mastitis. The results of identification test showed that the mainly pathogen were Staphylococci and Streptococci（87.1%），followed by all kinds of bacillus（12.9%）. The drug sensitivity test showed that most pathogens were resistant to common mastitis drugs.

Key words： cow mastitis； pathogen； tolerance；prevention and control measure

奶牛乳房炎是奶牛的多發(fā)病之一，也是奶牛發(fā)生較頻繁和較昂貴的疾病之一，是影響奶牛業(yè)發(fā)展的主要疾病之一。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道，目前全世界約有2.2億頭奶牛，其中約有1/3的奶牛患有各種類型的乳房炎，每年因乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失超過350億美元[1]。引起奶牛乳房炎的主要病原微生物為細(xì)菌、病毒、支原體和真菌等，以細(xì)菌性病原微生物為主。在中國現(xiàn)有奶牛群中，臨床乳房炎發(fā)病率為9.7%～55.6%，隱性乳房炎陽性率達(dá)到61.0%～79.6%[2]。中國奶牛乳房炎的發(fā)病率高于世界平均水平，由此造成的不良影響也更嚴(yán)重。有報道稱，中國每年由乳房炎導(dǎo)致的奶產(chǎn)量下降的損失達(dá)到1 200～3 600元/頭以上，占乳房炎總損失的69.0%～80.0%[3]。奶牛乳房炎的發(fā)生除因病原微生物感染外，還與各地區(qū)氣候環(huán)境、畜舍環(huán)境、管理措施、奶牛自身以及遺傳因素有關(guān)。中國對該病的研究起步較晚，雖然取得了顯著的成績，但還有許多問題沒有解決。另外，國家衛(wèi)生部門對鮮奶的藥物殘留有嚴(yán)格的控制標(biāo)準(zhǔn)，而臨床用藥又極易導(dǎo)致鮮奶中藥物殘留超標(biāo)。這導(dǎo)致臨床用藥受到限制，并且病原菌耐藥性增強(qiáng)、抗原變異、血清型復(fù)雜等因素，綜合導(dǎo)致奶牛乳房炎難以控制。

目前，奶牛乳房炎的防制仍然以加強(qiáng)管理、藥物治療和免疫預(yù)防等措施為主。為了使防制措施的效果更加顯著，必須對病原的流行病學(xué)、耐藥性、生物學(xué)特性等有較全面的認(rèn)識。因此，開展奶牛乳房炎的病原分析和防控研究，為該病的防制提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，并為新型防制方法研究提供生物學(xué)材料。

1 材料與方法

1.1 奶樣

從武漢周邊地區(qū)奶牛場采集奶樣126份。采集奶樣前，先用溫水清洗乳頭及乳房，擦干，棄除頭三把奶，用滅菌的7 mL離心管收集約5 mL牛奶，做好標(biāo)記，立刻置于冰盒中儲存，48 h內(nèi)送至實驗室進(jìn)行病原菌分離。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

LB瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基和TSB培養(yǎng)基；無支原體新生牛血清購自GIBCO公司；生化鑒定用微量發(fā)酵管和藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其他試劑為分析純。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分離與培養(yǎng) 將無菌采集的樣品用接種環(huán)直接劃線接種于TSA培養(yǎng)基（含5%新生牛血清）和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。挑取典型菌落，劃線接種于新的TSA培養(yǎng)基。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，初步鑒定細(xì)菌特征。如果鏡檢發(fā)現(xiàn)菌落不純，可再次挑取單菌落劃線培養(yǎng)，直至純化。

1.3.2 病原菌的生化鑒定 將革蘭氏陽性球菌接種不同微量發(fā)酵罐進(jìn)行厭氧培養(yǎng)、需氧培養(yǎng)、葡萄糖發(fā)酵試驗以及觸酶試驗，若結(jié)果均為陽性，擬定為葡萄球菌；以上結(jié)果中除觸酶試驗陰性外，其余為陽性者，擬定為鏈球菌；革蘭氏染色為陰性桿菌，麥康凱平皿上菌落為粉紅色、VP試驗陰性、脲酶試驗陰性、枸櫞酸鹽試驗陰性、MR試驗和吲哚試驗陽性者為大腸桿菌。

1.3.3 病原菌的PCR鑒定 參考相關(guān)文獻(xiàn)報道的PCR方法，用特異性的引物對金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌進(jìn)行鑒定。對未區(qū)分種屬的細(xì)菌用16S rDNA通用引物[4]進(jìn)行擴(kuò)增，通過測序鑒定細(xì)菌的類別。對已鑒定的金黃色葡萄球菌采用莢膜多糖分型引物[5]進(jìn)行莢膜多糖分型。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取病原菌的基因組作為PCR模板，進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，并進(jìn)行基因測序。試驗中設(shè)置不加模板的試劑對照。擴(kuò)增中所使用的引物[6，7]如表1所示。

1.3.4 耐藥性試驗試驗 選取注射用青霉素鈉、注射用硫酸鏈霉素、注射用頭孢噻呋鈉、注射用鹽酸多西環(huán)素、注射用氯唑西林鈉、硫酸卡那霉素、乳宮無抗（主要成分為魚腥草）、邦城乳炎專家（主要成分為魚腥草）、乳癰快克（主要成分為硫酸小檗堿）、魚腥草注射液、格潤常寧（主要成分為穿心蓮）11種常用藥物的藥敏紙片或藥液（5 μL），應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散法[8]測定主要病原菌對抗菌藥物的敏感性。取各細(xì)菌純培養(yǎng)接種于TSB液體培養(yǎng)基（含5%新生牛血清），37 ℃振蕩培育8 h。用無菌棉簽吸取適量菌液，在TSA平板表面均勻涂布，然后按一定距離放置各種藥敏紙片。37 ℃培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與鑒定

采集的126份奶樣中，有62份奶樣分離到病原菌，即奶牛乳房炎陽性率為49.2%（62/126）。對分離到的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)主要為革蘭氏陽性球菌，其次為桿菌。生化試驗和PCR鑒定結(jié)果（圖1至圖4）顯示，引起奶牛乳房炎的病原菌主要是葡萄球菌和鏈球菌，其中金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和大腸桿菌占到分離細(xì)菌的62.9%（39/62）。其他葡萄球菌和鏈球菌占24.2%（15/62）。另有枯草芽孢桿菌、乳酸乳桿菌和沙門氏菌等，占12.9%（8/62）。金黃色葡萄球菌中帶有5型莢膜多糖基因的占72.2%（13/18），帶有8型莢膜多糖基因的占11.1%（1/18）。各病原菌的數(shù)目及比例統(tǒng)計見表2。

2.2 藥敏試驗

對各主要病原菌進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果（表3）表明，不同病菌對藥物的藥敏性表現(xiàn)出差異。不同牛場分離的同種細(xì)菌對同種藥物也呈現(xiàn)出不同的敏感性，大部分病原菌能夠抵抗3種以上的抗菌藥物。金黃色葡萄球菌對部分魚腥草注射液、穿心蓮注射液和硫酸卡那霉素較敏感，對青霉素鈉、頭孢噻呋鈉等藥物的抵抗性較強(qiáng)；其他葡萄球菌對硫酸鏈霉素、穿心蓮注射液和部分魚腥草注射液較敏感，對青霉素和頭孢噻呋鈉抗性較強(qiáng)；近半數(shù)無乳鏈球菌對硫酸鏈霉素、鹽酸多西環(huán)素、氯唑西林鈉、魚腥草注射液和穿心蓮注射液較敏感，對其他藥物普遍不敏感；其他鏈球菌對硫酸鏈霉素、鹽酸多西環(huán)素、穿心蓮注射液和部分魚腥草注射液較敏感；大腸桿菌對鹽酸多西環(huán)素、硫酸卡那霉素、穿心蓮注射液和部分魚腥草注射液制劑敏感。

試驗結(jié)果表明，細(xì)菌對青霉素鈉和頭孢噻呋鈉2種常用抗生素表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抵抗性，敏感率分別為13.2%（7/53）和22.6%（12/53）。病原菌對乳癰快克的總敏感率只有15.1%（8/53），部分魚腥草注射液幾乎沒有抗菌效果。

3 小結(jié)與討論

引起奶牛乳房炎的病原菌種類眾多，有細(xì)菌、真菌、支原體等[9]，其中主要的病原菌是細(xì)菌。本研究對臨床采集的患牛乳樣進(jìn)行了細(xì)菌分離，結(jié)果顯示引起乳房炎的病原菌主要為革蘭氏陽性球菌，其次是一些腸道桿菌和環(huán)境中的桿菌，這與相關(guān)報道也是一致的[10]。生化鑒定結(jié)合PCR鑒定顯示，其中革蘭氏陽性球菌多為傳染性病原菌，且極易導(dǎo)致乳房炎，這些病菌包括金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌等。其他的機(jī)會致病菌為環(huán)境中的常在菌，例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌等，可通過污水、泥土、空氣和糞便等傳播。金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌等乳房炎主要病原菌則主要通過擠奶過程接觸傳播，如擠奶工的手、污染的毛巾和未徹底消毒的擠奶杯等。因此，規(guī)范擠奶操作、保持牛床衛(wèi)生、及時消毒用具等是預(yù)防乳房炎的重要措施。對于已經(jīng)患乳房炎的奶牛，應(yīng)及時隔離治療，避免成為畜舍的傳染源。由于尚無可靠的血清型鑒定方法，也沒有購買到分型血清，本研究僅對最主要的病原菌金黃色葡萄球菌作了PCR分型，結(jié)果表明目前流行的金黃色葡萄球菌主要含5型莢膜多糖基因，這與張倩等[11]報道的結(jié)果相似。

不同地區(qū)牛場分離的病原菌種類存在一定差異，這可能與牛場的衛(wèi)生管理措施、操作習(xí)慣和地區(qū)氣候有關(guān)系。武漢周邊地區(qū)采集的乳房炎樣本中，金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌的分離率最高。其他桿菌中有3株大腸桿菌、2株乳酸桿菌、2株沙門氏菌和1株枯草芽孢桿菌。從病原菌所占的比例來看，流行的主要病原均為金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性球菌。藥敏試驗結(jié)果表明，許多病原菌對抗生素的敏感性較差，這可能與抗生素的濫用有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)病原菌對部分廠家生產(chǎn)的某些中藥制劑比較敏感，這可能與中藥的殺菌成分較復(fù)雜有一定的關(guān)系[12]，也提示使用中藥制劑治療可能會收到良好的效果。但不同廠家生產(chǎn)的同類中藥制劑效果相差很大，有些中藥制劑幾乎沒有什么抑菌效果。研究發(fā)現(xiàn)，硫酸卡那霉素抑菌抑菌效果較好，各種病菌對它的敏感率在50.0%～88.9%，這可能與其毒性較大[13]，臨床上使用較少有關(guān)。病原菌對臨床上經(jīng)常使用的青霉素鈉和頭孢噻呋鈉抵抗性較強(qiáng)，提示這些藥物的大量使用會增強(qiáng)病原菌的耐藥性。

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