羅曉霞， 云永超， 李長玲， 張 銳

(1 廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524088；2 廣東海洋大學，廣東省藻類養(yǎng)殖及應(yīng)用工程技術(shù)中心，廣東 湛江 524088；3 廣東海洋大學深圳研究院，廣東 深圳 518108；4 海南祿泰海洋生物科技有限公司，海南 文昌 571300 )

在“藻類—浮游動物—魚類”的水生食物鏈中，藻類(初級生產(chǎn)者)是食物鏈中最底層的基礎(chǔ)元素的提供者，是草食性浮游動物產(chǎn)量的限制因子之一，而浮游動物的產(chǎn)量則影響了最上層營養(yǎng)級魚類的產(chǎn)量[1-2]。藻類的氮(N)、磷(P)含量決定了其作為浮游動物的食物質(zhì)量[3-6]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)：N、P缺乏會影響藻類的脂肪酸成分，導(dǎo)致藻類的多不飽和脂肪酸PUFAs(Poly Unsaturated Fatty Acids)降低[1,7-8]，從而限制浮游動物的產(chǎn)量[9-11]；高N含量小球藻培養(yǎng)的透明溞(Daphniahyalina)的內(nèi)稟增長率比低N含量小球藻組更高[11]；當攝食的藻體 P含量降低時，大型溞(Daphniamagna)的生長率也隨之下降[5]；藻體N含量越低，浮游動物的穩(wěn)定同位素δ15N值越高，浮游動物攝食不同N含量的同一種藻類時，其穩(wěn)定同位素δ15N值變化范圍為0‰～6‰[12]。因此，藻類的N、P含量變化影響水生食物網(wǎng)的生產(chǎn)力及營養(yǎng)級判斷。水體中營養(yǎng)鹽含量不僅影響藻類的生長率，同時還影響藻類細胞的N、P組成[13]。對于不同氮、磷營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度對米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)[14]、銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)[15]、剛毛藻(Cladophoraglomerata)[16]、小球藻(Chlorellasp.)[17]等藻類生長的影響已有相關(guān)報道。Hessen等[5]研究發(fā)現(xiàn)，隨著磷營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度的增加，月牙藻(Selenastrumcapricornutum)自身的N、P含量越高。不同氮磷比(N∶P)營養(yǎng)鹽培養(yǎng)的藻類的氮磷比也不同[11]。但是對于藻類在不同營養(yǎng)鹽下，其藻體N、P含量的具體數(shù)值變化尚缺乏豐富的數(shù)據(jù)。

斜生柵藻(Scenedesmusobliqnus)是養(yǎng)殖池塘中浮游植物的優(yōu)勢種，不僅是浮游動物的優(yōu)質(zhì)食物來源，也是鯉魚和草魚等經(jīng)濟魚類高產(chǎn)的關(guān)鍵[18-19]。本文研究了不同磷質(zhì)量濃度營養(yǎng)鹽對斜生柵藻生長和化學組成(碳、氮、磷)的影響，以期為養(yǎng)殖池塘水生食物網(wǎng)能量傳遞影響機制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)基

斜生柵藻(Scenedesmusobliqnus)藻種由暨南大學水生所藻種室提供，采用藍綠藻BG11(Blue-Green Medium)培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)液用密理博超純水儀(Diect-Q3，Milllipore)配制，經(jīng)高壓滅菌后供培藻用。

1.2 試驗設(shè)置

以BG11培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，配置成無磷培養(yǎng)基，再以三水磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)為磷源，通過添加不同體積的三水磷酸氫二鉀，分別配制0.005 4、0.054、0.54、2.7、5.4和8.1 mg/L共6個不同初始磷質(zhì)量濃度梯度的培養(yǎng)液組，同時設(shè)置無磷BG11培養(yǎng)液為對空白對照組，每梯度設(shè)3個平行。

1.3 接種培養(yǎng)

斜生柵藻培養(yǎng)10 d后，選處于指數(shù)生長期的藻進行試驗。取不同磷質(zhì)量濃度的培養(yǎng)液400 mL于1 000 mL 錐形瓶，在無菌操作臺(VS-840K，蘇州安泰有限公司)加入藻液20 mL，起始藻密度控制在20×104個/mL，置于光照恒溫培養(yǎng)振蕩器(TS-111GZ型，常州高德儀器制造有限公司)培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，光照度為56 μmol / (m2·s)，光暗比12 h∶12 h。試驗結(jié)束時對藻類進行計數(shù)，測藻體干重及碳(C)、氮(N)、磷(P)含量。

1.4 斜生柵藻計數(shù)及大小測量

試驗結(jié)束時，取20 mL藻液，加入魯格試劑[20]固定保存，在光電顯微鏡下隨機測量30個藻體細胞的大小[20]，并用血球計數(shù)板進行計數(shù)。

1.5 細胞干重測定方法

預(yù)先記錄玻璃纖維濾膜(GF/F，沃特曼Whatman，450 ℃預(yù)燃燒4 h)的質(zhì)量。用GF/F濾膜抽濾50 mL藻液，置于60 ℃烘至恒重并稱重，記錄下藻體和濾膜的總質(zhì)量。

1.6 藻體N、P含量測量

氮、磷的測定方法分別按張允法等[21]、彭華波[22]的方法進行，用紫外分光光度計(UV-5500)進行測定。每個平行組取10 mL藻液離心，去除上層清液，再補充相同體積的超純水，重復(fù)離心2次后，補充超純水至10 mL，用吸管把藻液打均勻，然后取2 mL測藻體P含量，取1 mL測藻體N含量。

1.7 藻體C含量的測量

用GF/F濾膜(沃特曼Whatman)于450 ℃預(yù)燃燒4 h后,抽濾50 mL 藻液,于60 ℃條件下烘至恒重,經(jīng)CHNS/O 元素分析儀(美國尼通公司)測其碳質(zhì)量。

1.8 計算方法

藻類生長率μ用下式計算。

μ=(lnN2-lnN1)/t

(1)

式中：t—培養(yǎng)時間，d；N2—最終的藻細胞濃度，個/mL；N1—起始藻細胞濃度，個/mL。

1.9 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 進行單因素方差分析,如果原始數(shù)據(jù)符合方差齊性,則運用Duncan多重比較方法(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 不同磷質(zhì)量濃度對斜生柵藻生長的影響

2.1.1 對斜生柵藻生長率的影響

不同磷質(zhì)量濃度對斜生柵藻的生長率有顯著的影響(P<0.05)(圖1)。斜生柵藻的生長率隨磷質(zhì)量濃度的升高而升高，含磷質(zhì)量濃度組的生長率顯著高于空白對照組。磷質(zhì)量濃度較高的0.54～8.1 mg/L組的斜生柵藻生長率顯著高于低濃度組(0.005 4 mg/L和0.054 mg/L),是低濃度組的2.4倍。其中，2.7 mg/L 磷質(zhì)量濃度組的生長率顯著高于0.54 mg/L組。但是當磷質(zhì)量濃度繼續(xù)增大到8.1 mg/L時，斜生柵藻的生長率和5.4 mg/L組的差異不顯著。表明斜生柵藻在磷質(zhì)量濃度為5.4 mg/L時，其生長率已到達較高水平，即使磷質(zhì)量濃度再繼續(xù)升高，斜生柵藻的生長率增長不明顯。

注：圖中字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.1.2 對斜生柵藻干重及細胞大小的影響

磷質(zhì)量濃度對斜生柵藻的干重有顯著的影響(P<0.05)(圖2)。斜生柵藻的單位體積干重(mg/L)隨著磷質(zhì)量濃度的增加而增加(圖2a)。當磷質(zhì)量濃度為2.7 ～ 8.1 mg/L時，斜生柵藻的干重顯著高于低質(zhì)量濃度組(0.005 4和0.054 mg/L)。0.54 和2.7 mg/L磷質(zhì)量濃度組的藻體單位體積干重差異不顯著； 5.4和8.1 mg/L磷質(zhì)量濃度組的藻體單位體積干重顯著高于其他組，但是這兩組的藻體單位體積干重差異不大。

斜生柵藻的單位細胞干重(mg/個)則與單位體積干重(mg/L)趨勢相反，磷質(zhì)量濃度越低，其單位細胞干重越大(圖2b)，低磷質(zhì)量濃度組(0.005 4和0.054 mg/L)及空白對照組的單位細胞干重達1.8×10-4mg/個，是較高磷質(zhì)量濃度組(0.54～8.1 mg/L)的4.5～5倍。當磷質(zhì)量濃度為0.54～8.1 mg/L時，單位細胞干重無顯著差異，為0.34×10-4～0.39×10-4mg/個。

磷質(zhì)量濃度越低，細胞個體越大，在磷質(zhì)量濃度為0～0.054 mg/L時，細胞的寬度達4.88～6.5 μm，明顯大于磷質(zhì)量濃度較高組(2.2～2.5 μm)(表1)。

圖2 不同磷質(zhì)量濃度下斜生柵藻的干重

細胞大小磷質(zhì)量濃度/(mg/L)00.005 40.0540.542.75.48.1長/μm12.8±0.513.0±1.812.1±1.610±1.811.5±0.311.6±0.412.4±0.1寬/μm6.5±0.36.4±0.94.88±0.12.5±0.42.4±0.42.4±0.12.2±0.1

2.2 不同磷質(zhì)量濃度對斜生柵藻化學組成的影響

磷質(zhì)量濃度對斜生柵藻藻體的P含量影響顯著(P<0.05)(圖3a,b)。斜生柵藻的P含量隨著培養(yǎng)液的磷質(zhì)量濃度的升高而升高。高濃度組(5.4和8.1 mg/L)的斜生柵藻的單位體積P含量顯著高于其他濃度組(圖3a)；磷質(zhì)量濃度為2.7和0.54 mg/L組的斜生柵藻的單位體積P含量顯著高于低濃度組(0.005 4 和0.054 mg/L)。斜生柵藻的單位細胞P含量在高濃度組(5.4和8.1 mg/L)達到最高值，為6.62×10-7～7.56×10-7mg/個(圖3b)，是其他濃度組的2～5倍；當濃度為0.005 4～2.7 mg/L時，其細胞P含量無顯著差異。

磷質(zhì)量濃度對斜生柵藻藻體的N含量影響顯著(P<0.05)(圖3c,d)。 磷質(zhì)量濃度較高的0.54～8.1 mg/L組的斜生柵藻的單位體積N含量顯著高于低磷質(zhì)量濃度組(0.005 4和0.054 mg/L)，其N含量是低磷質(zhì)量濃度組的1.5倍，但是隨著磷質(zhì)量濃度的增加，斜生柵藻的N含量差異并不明顯(圖3c)。低磷質(zhì)量濃度組(0.005 4和0.054 mg/L)斜生柵藻的單位細胞N含量則顯著高于0.54～8.1 mg/L 磷質(zhì)量濃度組，而0.54～8.1 mg/L磷質(zhì)量濃度組的單位細胞N含量無顯著差異(圖3d)。

注:字母不同代表差異顯著(P<0.05)

圖4 不同磷質(zhì)量濃度對斜生柵藻藻體

在不同磷質(zhì)量濃度下，斜生柵藻藻體的C含量隨著磷質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加，當磷質(zhì)量濃度為0.54～8.1 mg/L時，其藻體的C含量是低磷質(zhì)量濃度的1.2～1.8 倍(圖4)。

磷質(zhì)量濃度對斜生柵藻的化學組成比率有明顯的影響。斜生柵藻的C∶N原子比在不同磷質(zhì)量濃度梯度下差別不大，C∶N范圍為11∶1～14∶1。藻體的C∶P、N∶P則隨著培養(yǎng)液磷質(zhì)量濃度的增高而急劇減少(表2)。培養(yǎng)液磷質(zhì)量濃度由0.005 4 mg/L 增加至8.1 mg/L，其藻體的C∶P減少25倍，N∶P減少31倍。

3 討論

3.1 不同磷質(zhì)量濃度對斜生柵藻生長的影響

有研究表明，營養(yǎng)鹽濃度是影響藻類生長的重要因素[13-14,23]。隨著磷質(zhì)量濃度升高，銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)的藻細胞密度呈增加趨勢[15]。小球藻在中高磷質(zhì)量濃度的環(huán)境中生長率比低磷質(zhì)量濃度的快[17]。本試驗的結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致，斜生柵藻單位體積干重及生長率均隨著磷質(zhì)量濃度的升高而升高(圖1、2、3)。磷質(zhì)量濃度過低會抑制藻類的生長[17]。本試驗中，當環(huán)境中磷質(zhì)量濃度低至0.005 4和0.054 mg/L時，斜生柵藻的生長顯著受到抑制(圖1)。因此，當磷質(zhì)量濃度 0.54 mg/L時，磷為斜生柵藻的生長限制因素。研究表明，磷質(zhì)量濃度過高也會抑制藻類的生長[14,17]。但本試驗中并沒觀察到該現(xiàn)象，磷質(zhì)量濃度最高的8.1 mg/L組與5.4 mg/L質(zhì)量濃度組的斜生柵藻的生長無顯著差異。原因可能是斜生柵藻細胞分裂速度有限，對營養(yǎng)鹽的吸收效率也有限，因此盡管磷質(zhì)量濃度更高，但是斜生柵藻的生長速度并沒有明顯的提高。

表2 不同磷質(zhì)量濃度對斜生柵藻藻體化學組成比率的影響

不同氮磷比的營養(yǎng)鹽對藻細胞的生長有明顯的影響，而不同的藻類，其生長的最適氮磷比不同[23]。新月柱鞘藻(Cylindrothecaclosterium)在營養(yǎng)鹽N∶P為160∶1 時，生長率最快；而青島大扁藻(Platymonashelgolandica)和米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)分別在4∶1和80∶1的條件下生長率最佳[21]。豐茂武等[15]及張猛等[16]研究發(fā)現(xiàn)，當N、P質(zhì)量比為40∶1時，銅綠微囊藻、剛毛藻(Cladophorasp.)的生長最佳。本試驗中斜生柵藻的生長趨勢隨著培養(yǎng)液N∶P比的降低而升高，生長最佳的高磷質(zhì)量濃度組(5.4和8.1 mg/L)所對應(yīng)的培養(yǎng)液N∶P為46∶1和31∶1(表2)，與豐茂武及張猛等[15-16]的研究結(jié)果接近。本試驗中，斜生柵藻在磷質(zhì)量濃度為0.54 ～ 8.1 mg/L時能正常生長，其最佳生長磷質(zhì)量濃度范圍為5.4～8.1 mg/L。

在營養(yǎng)鹽限制條件下，某些微藻的細胞形態(tài)會發(fā)生不同程度的變異，從而更加適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境[24]。雖然低磷質(zhì)量濃度組(0.005 4和0.054 mg/L)的斜生柵藻的單位體積干重(mg/L)顯著低于其他磷質(zhì)量濃度組(0.54～8.1 mg/L)，但是單位細胞干重(mg/個)則顯著高于磷質(zhì)量濃度較高組(圖2)，表明在磷限制的情況下，斜生柵藻細胞密度減少，但是細胞大小增大。綠藻在磷缺乏的情況下，藻體自身會存儲大量的碳淀粉顆粒，因此導(dǎo)致細胞個體增大。藻類在營養(yǎng)鹽(氮、磷)限制的情況下，細胞個體的脂肪含量增高[25]。本試驗中，發(fā)現(xiàn)低磷質(zhì)量濃度組的斜生柵藻細胞個體增大、細胞壁明顯增厚的現(xiàn)象。因此，微藻在磷限制的情況下，藻體細胞不僅形態(tài)發(fā)生變化，而且細胞的生化成分也會發(fā)生變化。

3.2 不同磷質(zhì)量濃度對斜生柵藻生化組成的影響

水體中營養(yǎng)鹽的含量不僅會影響藻類的生長率，同時還會影響藻類細胞的生化組成[5-6,13]。Hessen等[5]研究發(fā)現(xiàn)，月牙藻(Selenastrumsp.)藻體的C、N、P含量與培養(yǎng)液中的磷質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性。本試驗發(fā)現(xiàn)，單位體積柵藻的C、N、P含量隨著培養(yǎng)液磷質(zhì)量濃度的升高而升高(圖3)。當外界磷含量發(fā)生變化時，藻體自身磷含量也相應(yīng)發(fā)生變化，這是藻類對外界環(huán)境的適應(yīng)反應(yīng)[5]。本試驗中，低濃度組的單位細胞 P含量顯著低于高濃度組，但是單位細胞N含量卻顯著高于高濃度組，表明細胞個體在P缺乏的情況下，為了體內(nèi)生化平衡，會大量吸收N元素，這也是藻類自我調(diào)整的策略。

Redfield定律常被認為適用于海洋、湖泊等水體中浮游植物的生長，藻類細胞組成的原子比通常為C∶N∶P=106∶16∶1，該原子比值被稱為Redfield比值[13,26-27]。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)海洋浮游植物的C∶N∶P比常常會偏離Redfield比值[28]。本試驗中，在不同P質(zhì)量濃度條件下，藻體的C∶N∶P原子比率不同(表2)。Goldman等[13]發(fā)現(xiàn)在沒有營養(yǎng)鹽限制、浮游植物生長率較高的水體，浮游植物的原子比通常趨向于Redfield比值。然而，當外部營養(yǎng)源、光照強度超過藻類生長所需的條件時，Redfield定律則不適用于藻類的原子比值[5,15]。本試驗中，當磷質(zhì)量濃度為2.7 mg/L時，藻體的C∶N∶P為148∶13∶1，最接近Redfield定律。而其他磷質(zhì)量濃度高于或低于2.7 mg/L的濃度組，其C∶N∶P均明顯偏離Redfield定律。因此，Redfield 定律只適用于沒有營養(yǎng)鹽限制且生長率較高的浮游植物。

磷缺乏會影響藻類的脂肪酸成分，導(dǎo)致藻類的多不飽和脂肪酸PUFAs(Polyunsaturated Fatty Acids)降低，而藻類PUFAs的含量決定了浮游動物的產(chǎn)量[1,7-8]。因此，當藻類的磷含量過低時，對于浮游動物來說是一種低質(zhì)量食物[1,5,9-11]，尤其是對于磷需求量較高的枝角類[1,6,29]。許多研究發(fā)現(xiàn)枝角類對食物中磷含量需求的最低閾值為C∶P=150∶300[1,9,30]。本試驗中，磷質(zhì)量濃度為0.005 4～0.54 mg/L時，藻體的C∶P低于枝角類(Daphnia)的最低食物需求，為212∶1～1 520∶1。因此，初始磷質(zhì)量濃度為0.005 4～0.54 mg/L 培養(yǎng)的斜生柵藻是一種低營養(yǎng)食物，不是浮游動物的適宜食物。環(huán)境中的磷質(zhì)量濃度不僅影響藻類的生長及生化成分，而且影響更高營養(yǎng)級浮游動物。然而，不同磷含量的斜生柵藻對于浮游動物生長的影響還有待進一步研究證實，從而為水生食物網(wǎng)能量傳遞影響機制提供基礎(chǔ)資料。

4 結(jié)論

磷質(zhì)量濃度對斜生柵藻的生長有顯著的影響(P<0.05)。斜生柵藻的生長率隨著初始磷質(zhì)量濃度的升高而升高。磷質(zhì)量濃度低于0.54 mg/L為斜生柵藻的生長限制因素。斜生柵藻在磷質(zhì)量濃度為0.54～8.1 mg/L時能正常生長，最佳生長磷質(zhì)量濃度范圍為5.4～8.1 mg/L。

磷質(zhì)量濃度對斜生柵藻藻體的C、N、P有顯著的影響(P<0.05)。斜生柵藻的單位體積C、N及P含量(mg/L)隨著營養(yǎng)鹽磷質(zhì)量濃度的升高而升高。高磷質(zhì)量濃度組的斜生柵藻的P含量顯著高于低質(zhì)量濃度組。低磷營養(yǎng)鹽下，單位細胞N含量顯著更高。

在不同磷質(zhì)量濃度下，斜生柵藻的C∶N原子比差異不大，C∶P比及N∶P比則隨著磷質(zhì)量濃度的增高而急劇減少。當磷質(zhì)量濃度為2.7 mg/L時，藻體的C∶N∶P比率接近Redfield比值。

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