■ 文｜中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 常藕琴 劉春 張德鋒 王亞軍 廖國禮 王慶 石存斌

流行性潰瘍綜合征（Epizootic Ulcerative Syndrome，EUS）是由真菌媒介絲囊霉菌（Aphanomycesinvadans）引起野生及養(yǎng)殖淡水與半咸水魚類體表潰瘍、骨骼肌形成典型霉菌性肉芽腫的一種季節(jié)性流行病。該病在生產(chǎn)中常容易誤診為細(xì)菌、病毒性疾病而忽略防治。目前全球至少有26個(gè)國家發(fā)現(xiàn)該病，感染魚類有100多種，EUS已引起世界各國關(guān)注。

雜交鱧（Channa maculata♀×C.argus♂）肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，其蛋白質(zhì)含量高，營養(yǎng)價(jià)值高。近年來，在珠江三角地區(qū)養(yǎng)殖規(guī)模逐步擴(kuò)大，成為重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類養(yǎng)殖品種。2012年以來，珠江三角地區(qū)許多淡水養(yǎng)殖場(chǎng)雜交鱧暴發(fā)了主要癥狀為體表潰瘍的疾病，大塊損傷多發(fā)生在軀干和背部，嚴(yán)重病例頭蓋骨軟組織和硬組織也形成潰瘍?cè)?，更有甚者尾部潰爛斷裂。該病多暴發(fā)于低水溫期和降大雨之后，發(fā)病率達(dá) 80%，死亡率達(dá)90%以上，幸存者也因體表潰爛，外觀丑陋，嚴(yán)重影響銷售，對(duì)雜交鱧養(yǎng)殖造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本文從病理組織學(xué)角度，對(duì)發(fā)病魚的潰瘍組織進(jìn)行病原分離和形態(tài)觀察，同時(shí)對(duì)其病變組織進(jìn)行活體壓片和病理組織觀察和診斷，初步確認(rèn)為潰瘍綜合癥，為臨床診斷、病理學(xué)研究及疾病的預(yù)防提供基礎(chǔ)依據(jù)。

圖1 雜交鱧流行性潰瘍綜合癥外觀

1.材料與方法

1.1 病魚來源

發(fā)病魚樣本采自廣東佛山市某淡水雜交鱧養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量 500g左右。發(fā)病期間水溫 15～20℃，主要癥狀為體表潰瘍。

1.2 活組織壓片和組織病理材料的制備

取自然發(fā)病魚的潰瘍?cè)?，活體壓片，光學(xué)顯微鏡觀察。取發(fā)病魚潰瘍?cè)睿?Bouin氏液固定 24h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。RM-2135型 Leica輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為 3～5μm，HE常規(guī)染色和 Grocott六胺銀染色，Nikon-e80顯微鏡觀察和攝影。

1.3 病原分離與觀察

從自然發(fā)病魚的潰瘍?cè)钐師o菌切取 2～4mm2的小片肌肉，置真菌肉湯培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng) 12h，將出現(xiàn)的菌絲轉(zhuǎn)移到新鮮的真菌瓊脂平板上，直到平板無其他污染菌為止。取帶有生長活力菌絲的一小塊瓊脂（直徑3～4cm），置于肉湯中 20℃孵育 4d，用滅菌的池塘水洗5次，然后于其中20℃過夜。大約 12h后觀察原代孢囊群落的形成。Nikon倒置顯微鏡下觀察，顯微攝影。

2.結(jié)果

2.1 臨床癥狀

患病初期，病魚反應(yīng)遲鈍，食欲下降，魚體發(fā)黑，病魚漂浮水面上，有時(shí)不停地異常游動(dòng)，體表無明顯癥狀；隨著病情發(fā)展，病魚體表、頭、鰓蓋或尾部可見紅斑，周圍充血紅腫；隨后出現(xiàn)較大紅色或灰色的淺部潰瘍，大塊損傷多發(fā)生在軀干和背部；嚴(yán)重病例頭蓋骨軟組織和硬組織壞死，腦部和內(nèi)臟裸露（圖1），在疾病后期病灶表面叢生菌絲，逐漸死亡。

2.2 活組織壓片和組織學(xué)觀察

活體壓片觀察到潰瘍肌肉組織中有大量霉菌樣微生物，菌絲纖細(xì)，很少分支，直徑約10～20μm（圖2-1）。

光學(xué)顯微鏡觀察 HE染色潰瘍?cè)钣械湫偷娜庋磕[結(jié)節(jié)，肌纖維溶解斷裂，其間有大量的霉菌性結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)中央是霉菌樣菌絲，外圍包裹上皮樣細(xì)胞和結(jié)締組織（圖2-2）；Grocott六胺銀染觀察到潰爛組織有大量的截面大小不等的褐色或棕色的真菌菌絲，這些霉菌樣菌絲有些被橫切呈圓形，截面較??；有些被斜切或縱切，呈絲狀，截面較大（圖2-3）。

圖2 絲囊霉菌樣微生物形態(tài)和組織學(xué)觀察

2-1 活體壓片組織中的真菌 (☆ )，標(biāo)尺100μ；2-2 侵襲到肌肉組織中的霉菌形成的肉芽腫結(jié)節(jié)（☆），H&E，標(biāo)尺 100μ；2-3 肌肉組織及肉芽腫結(jié)節(jié)中侵襲的真菌（☆），Grocott六胺銀染色，標(biāo)尺 200μ；2-4 菌絲頂端排列較多的孢子形成孢子囊（藍(lán)箭頭）和釋放出來的動(dòng)孢子堆積在菌絲周圍（箭頭），標(biāo)尺100μ。

2.3 病原分離與形態(tài)觀察

無菌操作下，病變組織于肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng) 12h，顯微鏡下觀察到分枝較少的纖細(xì)絲狀菌絲，直徑約 10～20μm，菌絲中沒有橫膈膜。菌絲置無菌塘水中 20℃過夜，鏡下可觀察到孢子在菌絲中分段排列，并有一定的間隔。孢子囊由不特化的菌絲形成，菌絲頂端孢子排列較多，形成孢子囊。肉湯中 20℃孵育 4d，形成的原代孢子群。有些動(dòng)孢子釋放出來，不散開，堆積在菌絲周圍，有些則分散在水中（圖2-4）。

3.討論

資料報(bào)道魚類潰瘍病可分離出氣單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、假單胞菌、弧菌、彈狀病毒、雙 RNA病毒和絲囊霉菌等病原。本研究發(fā)病雜交鱧大部分體表潰瘍，主要在體側(cè)、背部、尾部或鰓蓋和頭頂部，潰瘍處有呈紅色，有呈灰白色，有些肌肉潰爛嚴(yán)重，骨骼裸露，與流行性潰瘍綜合癥臨床癥狀相似。依據(jù)臨床癥狀，病原形態(tài)、原代孢囊群落形成特征和組織學(xué)觀察，初步診斷為絲囊霉菌引起的流行性潰瘍綜合征。

水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中，潰瘍綜合征在低溫下發(fā)病，一般認(rèn)為在自然情況下，發(fā)病可能是由于集約化程度高，養(yǎng)殖密度過大，致使魚體容易損傷和體質(zhì)下降，給病原菌提供了致病機(jī)會(huì)。目前對(duì)絲囊霉菌傳播途徑、致病機(jī)理和防治研究報(bào)道極少。因此對(duì)該病的傳播途徑、早期診斷、快速檢測(cè)、致病機(jī)理和預(yù)防治療等方面作進(jìn)一步研究具有重要意義。