郞明洋 付長(zhǎng)華

（花園藥業(yè)股份有限公司，浙江金華322121）

0 引言

茶為山茶科植物茶（Camellia sinensikuntze）的芽葉，具有抗氧化、抗衰老、抗輻射、防治心血管疾病、防癌抗癌及調(diào)節(jié)免疫等多種功效[1]，被應(yīng)用于食品、飼料、化妝品、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域[2]。研究表明，從茶葉中提取的茶多酚在增強(qiáng)人體健康方面具有重要的作用。茶多酚因其獨(dú)特的藥理性質(zhì)備受關(guān)注[3]，許多體內(nèi)和體外研究都表明茶多酚在預(yù)防癌癥，治療慢性胃炎、神經(jīng)退化和心血管疾病中具有重要作用[4]。

我國(guó)茶園種植面積居世界首位，茶資源豐富，利用碎末茶、中低檔茶與夏秋茶提取茶多酚的工藝非常成熟[2]。

本文對(duì)茶葉主產(chǎn)區(qū)浙江省多個(gè)產(chǎn)地的茶葉質(zhì)量進(jìn)行分析，以表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子酸（GA）及咖啡因（Caf）的含量為指標(biāo)進(jìn)行考察研究，為企業(yè)選擇生產(chǎn)原料提供依據(jù)。

隨著茶多酚應(yīng)用的開發(fā)，其分析方法也不斷得到提高和完善，用于測(cè)定茶多酚含量的方法有光譜法、電化學(xué)法、滴定法、色譜法等[5]。非色譜法只能測(cè)定茶多酚總量，而色譜法具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可以用于茶多酚單一成分的測(cè)定，其中常用的有高效液相色譜法、氣相色譜法、質(zhì)譜法等等[6]。本研究采用高效液相色譜法進(jìn)行茶多酚含量的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣品（共收集14批不同產(chǎn)地的茶葉原料）：杭州市徑山鎮(zhèn)（編號(hào)1、2、3、4）、紹興市新昌縣（編號(hào)5、6、7）、金華市磐安縣（編號(hào)8、9、10、11）、東陽市東白山（編號(hào)12、13、14）。

對(duì)照品：表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子酸（GA）及咖啡因（Caf），購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

試劑：乙腈（色譜級(jí)），購(gòu)于美國(guó)TEDIA公司；磷酸（色譜級(jí)）、甲酸（分析純），購(gòu)于阿拉丁生化科技有限公司；水（純凈水），購(gòu)于杭州娃哈哈集團(tuán)；氫氧化鈣（分析純），購(gòu)于GENERAL-REAGENT。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀，VWD檢測(cè)器（安捷倫科技有限公司）；METTLER TOEDO ME204E（萬分之一）、METTLER TOEDO XS105（十萬分之一）分析天平（梅特勒股份有限公司）；恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件[7]

色譜柱為Agilent SB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）加保護(hù)柱；流速：1.0 m L/m in；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸溶液（10∶90）為流動(dòng)相A，乙腈-0.2%磷酸溶液（80∶20）為流動(dòng)相B，按照0～10m in時(shí)A為100%，10～30m in時(shí)A從100%到90%，30～50 min時(shí)A從90%到100%，50～60m in時(shí)A為100%進(jìn)行梯度洗脫。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

取表兒茶素（EC）對(duì)照品、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）對(duì)照品、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對(duì)照品、咖啡因（Caf）對(duì)照品和沒食子酸（GA）對(duì)照品適量，精密稱定，分別加25%甲醇制成每lm L含表兒茶素68μg、表兒茶素沒食子酸酯0.14mg、表沒食子兒茶素沒食子酸酯0.85mg、咖啡因14μg、沒食子酸20μg的溶液，即得。

1.3.3 供試品溶液的制備[8]

將各批次樣品粉碎成中粉，稱取約2.0 g，精密稱定，置于1 L燒杯中，加入新煮沸的純凈水400m L，在95℃熱水水浴鍋中保溫10m in，每隔30 s攪拌1次；溫浸結(jié)束后冷卻至室溫，過濾到500m L容量瓶中，并用少量純凈水洗滌燒杯和樣品殘?jiān)?～3次，合并濾液；在量瓶中加入甲酸0.5m L，再加水定容至刻度，搖勻；用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍考察

精密稱取一定量對(duì)照品，加甲醇溶解，配置成一系列梯度濃度，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，得到茶葉相關(guān)對(duì)照品混標(biāo)圖譜，如圖1所示。分別以各組分的濃度（μg/m L）為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到5種組分的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表1所示。

圖1 茶葉相關(guān)對(duì)照品混標(biāo)圖譜

表1 各組分線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（n=6）

從圖1、表1可知，茶葉各組分在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取對(duì)照品混標(biāo)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20μL，分別得到表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子酸（GA）及咖啡因（Caf）峰面積的RSD分別為1.14%、0.30%、0.22%、0.87%、0.46%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取新制備的杭州市徑山鎮(zhèn)1號(hào)茶葉樣品溶液，每隔一段時(shí)間進(jìn)樣分析1次，進(jìn)樣量20μL。結(jié)果顯示，在樣品溶液制備好后的14 h內(nèi)，表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子酸（GA）及咖啡因（Caf）峰面積的RSD分別為1.42%、0.69%、1.52%、0.74%、0.81%，供試品溶液在14 h內(nèi)穩(wěn)定，符合相關(guān)規(guī)定。

2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取干燥的杭州市徑山鎮(zhèn)1號(hào)茶葉樣品，按“1.3.3”項(xiàng)下方法平行制備5份樣品，進(jìn)樣量20μL，依據(jù)所獲得的峰面積求得各組分在茶葉樣品中的含量。結(jié)果顯示，在5份樣品溶液中，表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子酸（GA）及咖啡因（Caf）含量的RSD分別為1.77%、1.65%、1.82%、1.61%、0.97%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取茶葉樣品（杭州市徑山鎮(zhèn)1號(hào)，EGCG含量3.84%）適量，精密稱取1.0 g，稱取6份，以樣品EGCG含量∶對(duì)照品EGCG含量=1∶1加入對(duì)照品，按“1.3.3”項(xiàng)下方法處理樣品，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)。結(jié)果顯示，EGCG的加樣回收率分別為101.965%、97.911%、103.288%、102.075%、101.494%、102.982%，平均值為101.619%，RSD為1.90%，表明該方法回收率良好，符合相關(guān)規(guī)定。

2.6 不同產(chǎn)地茶葉樣品含量測(cè)定

每個(gè)產(chǎn)地隨機(jī)選取多份樣品，所有茶葉樣品按“1.3.3”項(xiàng)下方法平行制備3份，用“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，進(jìn)樣量20μL（可根據(jù)具體含量情況進(jìn)行調(diào)整）。

將獲得的各組分峰面積值代入“2.1”項(xiàng)下相應(yīng)的回歸方程中，求取各樣品溶液的濃度，計(jì)算各組分在茶葉樣品中的含量，結(jié)果如表2所示。圖2～圖6為不同產(chǎn)地茶葉中不同組分含量比較。

3 結(jié)語

本研究通過方法學(xué)驗(yàn)證，證明了該含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便可行，樣品制備方法簡(jiǎn)便，提取充分[7、9]，可用于茶葉原料中表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子酸（GA）及咖啡因（Caf）的含量檢測(cè)。研究結(jié)果表明：不同產(chǎn)地之間除沒食子酸（GA）含量差別不顯著外，其余含量存在顯著差異。其中，茶葉中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的含量與產(chǎn)地及加工密切相關(guān)，同一產(chǎn)區(qū)不同采收批次之間存在顯著差異，不同產(chǎn)地茶葉中表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子酸（GA）及咖啡因（Caf）的含量區(qū)間分別為0.57%～0.85%、0.13%～1.78%、0.51%～7.04%、0.15%～0.31%、1.63%～3.37%。

我國(guó)作為茶樹栽培及茶葉加工的發(fā)源地，茶葉分布較廣，茶葉大部分經(jīng)加工后用于泡茶飲用，是一種世界性飲料[10]。我國(guó)出現(xiàn)了如綠茶、紅茶、烏龍茶、特種茶等聞名世界的茶品。與此同時(shí)，茶葉也被深加工為茶葉提取物，用作藥品和膳食補(bǔ)充劑的原料[11]。本研究通過對(duì)浙江省四個(gè)主要茶葉產(chǎn)地不同批次間的茶葉主要成分含量進(jìn)行比較分析，以期為茶葉人工培育和GAP基地建設(shè)提供依據(jù)，同時(shí)為企業(yè)的茶葉提取物制備提供原料篩選方法。

表2 不同產(chǎn)地茶葉樣品中主要成分含量（n=3）

圖2 不同產(chǎn)地茶葉中EC含量比較

圖3 不同產(chǎn)地茶葉中ECG含量比較

圖4 不同產(chǎn)地茶葉中EGCG含量比較

圖5 不同產(chǎn)地茶葉中GA含量比較

圖6 不同產(chǎn)地茶葉中Caf含量比較