侯曉旭，李澍，王浩，羅維娜，王權，任海萍

中國食品藥品檢定研究院 醫(yī)療器械檢定所，北京 102629

引言

目前除心臟移植外，心室輔助裝置已經(jīng)作為一種臨床上可供考慮的選擇，對心力衰竭的病人進行輔助，提高患者的生活質(zhì)量和生存率[1-2]。目前市面可用的心室輔助裝置基本都是連續(xù)旋轉(zhuǎn)式血泵（軸流泵和離心泵），溶血性是這些裝置的關鍵性能為之一，用于評價血泵對血液的損傷程度。從不良事件反饋上看，目前出現(xiàn)的中風等術后不良反應都與血泵溶血性能有關[3-4]。因此，量化心室輔助裝置的血液損傷程度、評價系統(tǒng)的溶血性能對質(zhì)量評價至關重要[5]。

從本質(zhì)上講，造成心室輔助裝置溶血的根本原因是機械剪切力和應力暴露時間[6]。不同于人體心臟的容積變化式的血流驅(qū)動，旋轉(zhuǎn)式血泵通過葉輪旋轉(zhuǎn)（一般都在1000 rpm以上），為血流提供動力[7]?？梢韵胂螅谌绱烁咚俚男D(zhuǎn)過程中，紅細胞會受到很大的剪切力作用，從而引起細胞的變形（收縮和拉伸）。當長時間暴露在強剪切力條件下，細胞變形超過細胞所能承受的程度，暴露時間超過了人體的自我修復速度，紅細胞可能失能而破裂，從而使細胞內(nèi)的血紅蛋白游離到血漿中[6,8]。

標準溶血指數(shù)（Normalized Index of Hemolysis，NIH）是定量衡量溶血的特征指標[9-10]。通過相對規(guī)范化的NIH測量可以定量了解血泵對血液的破壞程度。一般認為NIH值大于＞0.1 g/100 L，則認為出現(xiàn)溶血。ASTM F1841-97[11]標準對連續(xù)流血泵的溶血測試給出了指導方法，血泵需經(jīng)過6 h溶血測試，每1 h進行一次血液采樣，最終用6 h測試的NIH平均值來評價血泵的溶血性能。本文在ASTM F1841-97的基礎上，針對標準中未進行詳細說明的部分進行細化和討論。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 血液采集的要求

血液采自正常體溫、明顯的疾病特征的動物血液，采集前禁食12 h。用大孔針（14 G）通過血管穿刺采集血液，并采集到含有肝素的標準血袋中。采血過程通過重力作用自然流出，或使用不超過100 mmHg的負壓引出。血液從采集到使用建議在24 h以內(nèi)，并在2℃～8℃環(huán)境下冷藏保存。血液在使用時推薦在37℃±1℃水浴下加溫至生理溫度。在水浴過程中要特別注意小氣泡的產(chǎn)生，這些小氣泡宜在進行體外實驗前通過取樣口進行消除。為了去除血液中的微粒、微血栓和聚集的血小板，在血液進入循環(huán)時用一個口徑為74 μm的濾網(wǎng)對血液進行過濾。

1.1.2 測試回路及工作條件

封閉測試回路包括一根總長為2 m，內(nèi)徑為9.5 mm的聚氯乙烯管，血袋（12 cm×12 cm），壓力傳感器，流量傳感器和待測試血泵。首先回路中應充滿生理鹽水，以清洗并濕潤所有與血液接觸的表面。在加血液之前，應通過采樣口去除回路中的小氣泡。根據(jù)血液初始血氣分析結(jié)果以及目標紅細胞壓積值，計算灌注血液目標體積和生理鹽水目標體積。按照目標體積從回路中抽出多余的生理鹽水，同時向回路中注入目標體積的血液，注意避免回路中產(chǎn)生氣泡。用以控制壓力條件的阻力閥應放在泵的出口側(cè)。在測試回路的入口及出口處連接壓力表，見圖1。泵的流量應設定為（5±0.25）L/min，循環(huán)血液溫度為37℃±1℃。壓力設定為（100±10）mmHg[12-13]。

圖1 測試回路

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗步驟

圖1中描述了溶血測試的標準閉合回路，該回路由一臺被測試的泵、血袋、三通采樣口、壓力傳感器及一個阻力閥組成。血液被加熱到37℃，通過重力作用經(jīng)過三通管灌輸?shù)綔y試回路中。開啟血泵，將其調(diào)整到待測試的試驗條件。在測試回路運行大約5 min，并且回路中的氣泡已排出之后，通過采樣口采集第一個血樣，作為0時間點的血樣。

測試周期為6 h，在血泵循環(huán)5 min后采集第一個血樣，之后每隔1 h采集一次，共計6個血樣。為了確保采樣的準確性，在采集血樣之前，對血袋進行輕輕地擠壓，并舍棄采樣口附近的2 mL血樣。在整個測試周期中循環(huán)血液溫度宜保持在37℃±1℃。

1.2.2 采樣過程

在循環(huán)期間，每小時從血袋中采集3～8 mL的血樣。在每次采樣時，采集兩份血樣，將第一次取的樣品丟棄，因為它可能會含有滯留在采樣口的一些血液。第二次采集的血樣應用于測量血漿游離血紅蛋白。

1.2.3 游離血紅蛋白濃度的測試

采集的血液通過離心法獲得上清血漿[14-15]。血漿中的游離血紅蛋白通常以氧合血紅蛋白的形式存在，將血漿使用0.1%碳酸鈉溶液稀釋后其在415 nm處存在強吸收峰，采用微孔板分光光度計（酶標儀）在415 nm波長處讀數(shù)測定氧合血紅蛋白吸光度值，并通過在380 nm和450 nm波長處的讀數(shù)消除血漿中尿卟啉的干擾。計算公式如下：

配 制 了 2.5、5、10、20、30、40、50、60、80、100、150 mg/dL濃度的血紅蛋白溶液，并加入0.01%的Na2CO3稀釋。最終測試結(jié)果如下，以血紅蛋白的吸光度對樣品濃度進行回歸分析，并得到標準濃度曲線：y=0.0018x+0.00123（圖2）。血紅蛋白濃度與吸光度在2.5～150 mg/dL范圍內(nèi)均成線性關系，相關系數(shù)達到0.99674。

圖2 血紅蛋白濃度與吸光度濃度標準曲線

1.2.4 數(shù)據(jù)計算和分析

報告每臺血泵的NIH平均值、標準偏差及變異系數(shù)。

式中： NIH表示標準溶血指數(shù)，單位為克每100 L（g/100L）；△free Hb指在采樣時間間隔內(nèi)，血漿游離血紅蛋白濃度的增加量（g/L）；V指回路容量，單位為升（L）；Q為流量，單位為升每分鐘（L/min）；Hct為紅細胞壓積，單位為百分比（%）；T為采樣時間間隔，單位為分鐘（min）。

2 討論

2.1 溶血限值的討論

不難設想，如果一個外來因素（例如心室輔助裝置）對紅細胞造成的破壞程度和速度不超過自然衰亡，那么可以認為該裝置是安全可行的。因此，生物體對游離血紅蛋白的耐受度一直受到學者的關注。從公式(1)來看，標準溶血指數(shù)的定義其實質(zhì)就是在單位時間內(nèi)，通過單位橫截面積所破壞的紅細胞的質(zhì)量。由于人體自身的骨髓具有造血功能，紅細胞會自然衰亡并不斷更新，大約3個月左右，血液中的紅細胞將全部更新一次。因此，我們可以大概估算下溶血指數(shù)的最大允許值（Haemolytic Index，HI）。設一個正常成人的紅細胞在血液中的密度是14 g/100mL[12]，人體的血液的平均流量為5 L/min，總體積為5 L。則

因此，溶血指數(shù)的極限值為0.1 g/dL。對任何一種心室輔助裝置而言，若想臨床應用，給予一定得冗余值，一般為最大值的十分之一左右，因此，要求其溶血指標必須保證不得高于0.01 g/dL。

2.2 入組血液質(zhì)量要求

血泵引起的溶血主要取決于血泵的設計、結(jié)構(gòu)和所使用的材料。用于體外評價血液破壞的血源在很大程度上將會影響血泵性能評價的結(jié)果。體外溶血試驗的試驗結(jié)果很大程度上會受到供血者物種、血液的生化狀態(tài)（堿剩余、葡萄糖）、血紅蛋白及紅細胞壓積等因素的影響。因此，用于體外評價血泵溶血性能的血液進行標準化是非常重要的，而且這將會使試驗結(jié)果具有普遍的可比性。

2.2.1 供血者物種的考慮

一般來說，供血物種包括牛、羊和豬等大動物以及志愿者的血液。Harboe[16]評估了剪切應力對牛、綿羊和豬血液中的細胞和蛋白質(zhì)的影響。并使用流變儀對來自不同物種的血液進行各種剪切速率0～8000 s分析。總體而言，增加剪切速率會使所有測試物種血液的血創(chuàng)傷增加。不同物種之間血液的破壞主要體現(xiàn)在溶血、血小板激活以及血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）的結(jié)構(gòu)和功能。與人血相比，在剪切力作用下，豬血具有最大的彈性、較少程度的溶血、相似的血細胞數(shù)量、較少的血小板激活以及較少的vWF損傷；牛血具有較少的溶血、相似的血細胞數(shù)量、較高的血細胞激活以及相似的vWF損傷，對于剪切力總體體現(xiàn)出較少的影響；綿羊血具有最小的彈性。牛血與人血最為相似，因此文獻建議用牛血來評估體外的溶血測試。

2.2.2 血液的生化狀態(tài)的考慮

為確保測試結(jié)果的準確性，游離血紅蛋白濃度超過20 mg/dL的待測血液將不被采用。測試用血液的血細胞比容應在28%～32%范圍內(nèi)。另外血液的其它指標如pH值、血糖等參數(shù)應在正常值范圍內(nèi)。血液的過酸或過堿都會導致血液的破壞。而另一方面，根據(jù)滲透學原理，當外界的葡萄糖濃度過低時，葡萄糖溶液中的水分子開始擴散進入紅細胞，最終使紅細胞吸水膨脹至破裂，因而產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。因此在體外測試溶血前，一般建議BE（堿剩余）調(diào)節(jié)在（0±5）nmol/L、葡萄糖濃度應大于90 mg/dL。

2.3 游離血紅蛋白檢驗方法的討論

測定血液中游離血紅蛋白濃度的方法有很多[15]，有物理測定方法，包括比重法、折射率法等，也可由根據(jù)血紅蛋白的化學結(jié)合力，如血紅蛋白可與O2和CO結(jié)合生成HBO2和HBCO，與氰化物結(jié)合生成氰化高鐵血紅蛋白，再根據(jù)衍生物的光譜特性進行測定。由于測量方法較多，導致實驗室間的檢測結(jié)果缺乏可比性。針對這種情況，國際血液學標準化委員會成立了血紅蛋白專家組,該專家組于1967年在測定了氰化高鐵血紅蛋白摩爾吸光系數(shù)的基礎上，確定了以氰化高鐵血紅蛋白法為血紅蛋白測試的參考方法。但使用的氰化鉀試劑含有劇毒物質(zhì)，對使用者及環(huán)境有一定的危害，謹慎考慮，我們采用了碳酸鈉測試方法對游離血紅蛋白濃度進行測試[15-16]?？傮w來說，碳酸鈉的化學性質(zhì)相對穩(wěn)定，且無毒無生物危險，水溶液呈堿性，能與血紅蛋白迅速結(jié)合形成紅色堿化血紅蛋白。因此，實際檢測中，采用碳酸鈉血紅蛋白測試法，能大量減少醫(yī)療廢棄物，很大程度上彌補氰化高鐵血紅蛋白法的不足，但為了保證試驗結(jié)果的準確性，建議使用全血質(zhì)控品或與氰化高鐵血法同時檢測進行校正。

3 結(jié)論

溶血特性是衡量VAD對血液成分和理化性質(zhì)影響的重要指標。通過溶血測試，評價血泵的溶血性能，對于保證血泵的有效性和安全性具有重要意義。溶血指數(shù)NIH的物理意義是反映輸出100 L壓積標準化血液產(chǎn)生的FHB含量，是目前世界上公認的體外評價血泵溶血性能的金標準。血泵設計廠商有必要使用具有良好血液相容性的血泵材料，并優(yōu)化加工工藝，使血泵具有良好的熱傳導性能和較低的機械產(chǎn)熱。設計時引入計算流體力學分析，優(yōu)化結(jié)構(gòu)設計，詳細分析泵體內(nèi)部流場和剪切應力分布，減少于溶血密切相關的高剪切力和振蕩剪切力分布區(qū)域，減少血液接觸面積。本文采用ASTM F1841-97標準，搭建了檢測平臺，進行了溶血指數(shù)測量，明晰了實現(xiàn)方法和細節(jié)，希望供研發(fā)和評價人員借鑒。

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