張曉晗， 萬 甜， 程 文， 王 敏， 任杰輝

(西安理工大學(xué) 西北旱區(qū)生態(tài)水利工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 陜西 西安 710048)

1 研究背景

喹諾酮類和磺胺類抗生素均是由人工合成的抗生素，具有廣譜抗菌性、強(qiáng)抗菌活性的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于人類疾病防治、畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[1-2]。研究表明，我國抗生素使用量已達(dá)到4 104 t，占世界比例的20%，而喹諾酮類以及磺胺類抗生素是使用頻次最高、水體中殘留量最大的兩類抗生素[3]。朱琳等[4]發(fā)現(xiàn)北京市清河水體主要污染物質(zhì)是中喹諾酮類抗生素，平均值為2238.9 ng/L。金磊等[5]發(fā)現(xiàn)華東地區(qū)某水源水中磺胺的檢出頻率為100%，濃度為43.1 ng/L。目前，有關(guān)抗生素對(duì)淡水綠藻的影響研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展。秦宏偉等[1]研究了氧氟沙星對(duì)斜生柵藻毒性作用，發(fā)現(xiàn)不同濃度的OFLX對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)均受到抑制且EC50值隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增大。劉濱揚(yáng)[3]研究紅霉素、環(huán)丙沙星和磺胺甲惡唑?qū)ρ蚪窃卵涝宓亩拘孕?yīng)，發(fā)現(xiàn)紅霉素對(duì)羊角月牙藻毒性更強(qiáng)。

綠藻作為水生生態(tài)系統(tǒng)中的初級(jí)生產(chǎn)者[6]，是監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)水環(huán)境質(zhì)量和污染物生態(tài)毒性的重要指示生物[7]，在維持生態(tài)系統(tǒng)平衡和穩(wěn)定狀態(tài)過程中扮演者十分重要的角色[8],當(dāng)這些抗生素存在于水體中時(shí)，會(huì)影響綠藻的生命代謝活動(dòng)，從而影響綠藻的生長(zhǎng)和生理活性[9]。葉綠素是評(píng)價(jià)藻類等浮游生物的生產(chǎn)力的重要指標(biāo)，如四環(huán)素類對(duì)藻細(xì)胞中葉綠素a含量具有抑制效應(yīng)，而青霉素對(duì)藻細(xì)胞葉綠素產(chǎn)生“低促高抑”的影響。研究表明，藻類是污染物毒性試驗(yàn)中理想的生物體，其生長(zhǎng)狀況以及生理生化特性的變化可以有效地反映出抗生素對(duì)它們的影響[10-11]。

本研究以蛋白小球藻、斜生柵藻兩種綠藻為試驗(yàn)對(duì)象，分析了氧氟沙星(喹諾酮類)、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺二甲基嘧啶(磺胺類抗生素)等3種抗生素在單一及聯(lián)合條件下對(duì)綠藻的敏感性，定量計(jì)算抗生素對(duì)綠藻的半抑制濃度，以期為全面認(rèn)識(shí)喹諾酮類、磺胺類抗生素對(duì)綠藻的毒理作用，為抗生素類藥物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)及水體富營化提供參考價(jià)值。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

供試普通小球藻(C. vulgaris)、斜生柵藻(S. obliquus)購自中國科學(xué)院水生生物研究所，試驗(yàn)所用氧氟沙星(Ofloxacin，OFLX)和磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonoethoxine，SMM)兩種抗生素，購自北京百靈威科技有限公司，其純度分別大于98%、95%，磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine，SMZ)抗生素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其純度大于99%。

2.2 藻細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)

在無菌條件下將5 mL藻種接種至10 mL BG11培養(yǎng)基中，于PRX-350B型智能人工氣候箱中恒溫光照培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的15 mL藻種接種于裝有75 mL培養(yǎng)基(1∶5)的錐形瓶中，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，光暗比 12 h∶12 h，光照2 000 Lux靜置培養(yǎng)，每天定時(shí)搖動(dòng)3～4次，以減少藻細(xì)胞貼壁現(xiàn)象。培養(yǎng)一段時(shí)間后，鏡檢細(xì)胞正常，進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期開始試驗(yàn)。

2.3 藻類指標(biāo)的測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的普通小球藻、斜生柵藻分別接種到100 mL的錐形瓶中，試驗(yàn)初始藻細(xì)胞濃度為12×106個(gè)/mL，總體積90 mL，加入不同濃度梯度的抗生素(抗生素濃度見表1)。抽取 65μL(55 μL培養(yǎng)基+5 μL抗生素+5 μL藻液)的培養(yǎng)液于分光光度計(jì)(酶標(biāo)儀)上測(cè)定在600 nm處的吸光度OD600，每天測(cè)定培養(yǎng)液的藻細(xì)胞濃度，做6組平行測(cè)定，在接種后分別觀察0、24、48和96 h的吸光度OD600， 以細(xì)胞干物質(zhì)重計(jì)的細(xì)胞濃度計(jì)算為：

CDW=OD600×0.4

(1)

式中：CDW為細(xì)胞干重，g/L。

表1用于敏感性試驗(yàn)的抗生素濃度 μg/mL

2.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin9.1軟件中非線性最小二乘擬合(NLSF)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素方法分析綠藻對(duì)不同濃度抗生素的敏感性。同時(shí)使用非線性函數(shù)模型對(duì)藻細(xì)胞第96 h生長(zhǎng)抑制數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，進(jìn)而求得各個(gè)擬合模型的相關(guān)參數(shù)。求得抗生素對(duì)藻類的半抑制濃度，定量分析抗生素對(duì)綠藻生長(zhǎng)的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 單一抗生素對(duì)綠藻生長(zhǎng)的影響

3.1.1 OFLX對(duì)綠藻生長(zhǎng)的影響 OFLX對(duì)普通小球藻、斜生柵藻生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖1。 OFLX對(duì)普通小球藻和斜生柵藻生長(zhǎng)均表現(xiàn)出“低促高抑”，在1～5 μg/mL的OFLX作用下，細(xì)胞干重大于對(duì)照組，表明綠藻的生命活性指數(shù)增加，生長(zhǎng)狀況良好，對(duì)綠藻的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞干重增量越來越小，促進(jìn)作用趨于平穩(wěn)；反之，當(dāng)OFLX濃度≥5 μg/mL時(shí)，細(xì)胞干重低于對(duì)照，對(duì)綠藻的生長(zhǎng)起抑制作用，濃度越大，抑制作用越顯著，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞干重變化越來越小，抑制率下降，10 μg/mLOFLX培養(yǎng)后兩種藻類細(xì)胞干重相比對(duì)照組分別減少了13.4%、5.8%，表明OFLX對(duì)斜生柵藻更為敏感。

圖1 氧氟沙星對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響

綠藻在第96 h已經(jīng)達(dá)到生長(zhǎng)階段的穩(wěn)定期。故用第96 h的細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)據(jù)分析抗生素抑制濃度，得到藻細(xì)胞濃度與抗生素濃度關(guān)系曲線。

擬合所得的普通小球藻對(duì)OFLX敏感性曲線表達(dá)式為：

Y=-0.0013X2+0.0105X+0.0794

(2)

(R2=99.13%)

取對(duì)照組生長(zhǎng)量的一半Y=1/2Y=0.08057，求得半抑制濃度為，X1/2=7.96 μg/mL，即OFLX對(duì)普通小球藻的半抑制濃度為7.96 μg/mL。

擬合所得的斜生柵藻對(duì)OFLX敏感性曲線表達(dá)式為：

Y=-0.0002X2+0.0013X+0.0782

(3)

(R2=95.95%)

取對(duì)照組生長(zhǎng)量的一半Y=1/2Y=0.07857，求得半抑制濃度為，X1/2=6.20 μg/mL，即OFLX對(duì)斜生柵的半抑制濃度為6.20 μg/mL。

分析OFLX對(duì)藻類的半抑制濃度可知，斜生柵藻對(duì)OFLX更為敏感。

3.1.2 SMM對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響 SMM對(duì)普通小球藻、斜生柵藻生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。當(dāng)SMM濃度為1 μg/mL，藻類的細(xì)胞干重在整個(gè)處理期內(nèi)與對(duì)照組無顯著差異，說明藻類可以耐受1 μg/mL的SMM，3、5 μg/mL的SMM處理藻類其細(xì)胞干重顯著高于對(duì)照組，隨后增量變小，促進(jìn)作用不明顯，在第48 h，濃度為5 μg/mL的SMM的處理下兩種藻類相比對(duì)照組增加了19.6%、27.9%，7、10 μg/mL的SMM處理細(xì)胞干重低于對(duì)照組，但始終呈增加趨勢(shì)，在第72 h、7 μg/mL的SMM培養(yǎng)的斜生柵藻細(xì)胞干重突增，隨后又顯著下降，10 μg/m LSMM培養(yǎng)后細(xì)胞干重相比對(duì)照組分別減少了12.1%、16.9%，表明SMM對(duì)普通小球藻更為敏感；SMM對(duì)普通小球藻和斜生柵藻生長(zhǎng)均表現(xiàn)出“低促高抑”。

圖2 磺胺間甲氧嘧啶對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響

取圖2中普通小球藻、斜生柵藻在第96 h的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，擬合所得的普通小球藻和斜生柵藻對(duì)SMM敏感性曲線表達(dá)式分別為式(4)和式(5)。

Y=-0.0002X2+0.0011X+0.0486

(4)

(R2=91.67%)

Y=-0.0005X2+0.0036X+0.0520

(5)

(R2=91.64%)

求得SMM對(duì)普通小球藻的半抑制濃度為6.58 μg/mL；SMM對(duì)斜生柵藻的半抑制濃度為7.20 μg/mL。分析SMM對(duì)藻類的半抑制濃度可知，普通小球藻對(duì)SMM更為敏感。

3.1.3 SMZ對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響 SMZ對(duì)普通小球藻、斜生柵藻生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。1～5 μg/mL的SMZ在開始培養(yǎng)藻細(xì)胞的細(xì)胞干重就顯著高于對(duì)照組，濃度越高，細(xì)胞干重增加越多，對(duì)藻類生長(zhǎng)的促進(jìn)作用越明顯，在第24 h時(shí)5 μg/mL的SMM處理的藻類相比對(duì)照組增加了30.4%、13.0%，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)增速趨于穩(wěn)定，7～10 μg/mL 的SMZ在處理后細(xì)胞干重就開始下降，且下降程度與濃度呈正相關(guān)，從整體來看隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞干重在少量增加，抗生素不僅抑制藻類生長(zhǎng)，對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生毒性，而且能改變其形態(tài)結(jié)構(gòu)，通過藻細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)一步抑制藻細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)繁殖；SMZ對(duì)普通小球藻和斜生柵藻生長(zhǎng)均表現(xiàn)出“低促高抑”。

圖3 磺胺二甲基嘧啶對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響

取圖3中普通小球藻、斜生柵藻在第96 h的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，擬合所得的普通小球藻和斜生柵藻對(duì)SMZ敏感性曲線表達(dá)式分別為公式(6)和公式(7)。

Y=-0.0004X2+0.0035X+0.0396

(6)

(R2=94.39%)

Y=-0.0003X2+0.003X+0.0407

(7)

(R2=90.55%)

求得SMZ對(duì)普通小球藻的半抑制濃度為8.19 μg/mL；SMZ對(duì)斜生柵藻的半抑制濃度為9.89 μg/mL。分析SMM對(duì)藻類的半抑制濃度可知，普通小球藻對(duì)SMZ更為敏感。

研究表明[1]OFLX對(duì)斜生柵藻的影響隨著暴露濃度的增大，斜生柵藻對(duì)OFLX生長(zhǎng)的抑制作用不斷增強(qiáng)，藻細(xì)胞分解隨著受試物濃度的增加逐漸增多。萬禁禁[12]研究發(fā)現(xiàn)低濃度抗生素(小于1 μg/L和10 mg/L)作用下，綠藻的抗氧化系統(tǒng)無明顯變化，高濃度抗生素作用下，綠藻抗氧化酶活性受到誘導(dǎo)，丙二醛含量顯著增加，藻的生長(zhǎng)受到抑制。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相一致。

3.2 聯(lián)合抗生素對(duì)綠藻生長(zhǎng)的影響

3.2.1 兩種聯(lián)合抗生素(OFLX+SMM)對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響 OFLX+SMM抗生素對(duì)普通小球藻、斜生柵藻生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。由圖4可看出，聯(lián)合抗生素作用下，各濃度抗生素對(duì)藻細(xì)胞的細(xì)胞干重變化趨勢(shì)趨與對(duì)照組相似，1、7 μg/mL 的聯(lián)合抗生素對(duì)藻細(xì)胞的細(xì)胞干重相比對(duì)照組無太大變化，3、5 μg/mL 的抗生素作用下，藻細(xì)胞的細(xì)胞干重高于對(duì)照組，產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用，10 μg/mL的抗生素作用下，細(xì)胞干重稍有減少，產(chǎn)生輕微的抑制作用， OFLX+SMM對(duì)普通小球藻和斜生柵藻生長(zhǎng)均表現(xiàn)出“低微促高輕抑”現(xiàn)象。相比單一抗生素，聯(lián)合抗生素對(duì)綠藻的作用較為溫和，高濃度抗生素對(duì)綠藻的抑制作用較差。

方章順等[13]研究表明，在毒性評(píng)價(jià)中，F(xiàn)C-30與SCP或TMP聯(lián)合時(shí)具有拮抗作用，對(duì)環(huán)境的影響小，同理，OFLX與SMM的濃度比1∶1時(shí)，其對(duì)綠藻的抑制作用較為溫和，小于單一抗生素的抑制率，OFLX+SMM對(duì)普通小球藻的半抑制濃度為8.28 μg/mL，大于單一抗生素對(duì)該藻類的半抑制濃度，表現(xiàn)為拮抗作用；對(duì)斜生柵藻的半抑制濃度為5.71 μg/mL，表現(xiàn)為協(xié)同作用。

圖4 氧氟沙星+磺胺間甲氧嘧啶對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響

取圖4中普通小球藻、斜生柵藻在第96 h的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，擬合所得的普通小球藻和斜生柵藻對(duì)(OFLX+SMM)敏感性曲線表達(dá)式為公式(8)和公式(9)：

Y=-0.0002X2+0.0019X+0.0483

(8)

(R2=95.84%)

Y=-0.0001X2+0.001X+0.0459

(9)

(R2=99.09%)

求得(OFLX+SMM)對(duì)普通小球藻的半抑制濃度為8.28μg/mL；(OFLX+SMM)對(duì)斜生柵藻的半抑制濃度為5.71μg/mL。分析聯(lián)合抗生素對(duì)藻類的半抑制濃度可知，斜生柵藻對(duì)OFLX+SMM更為敏感。

3.2.2 3種聯(lián)合抗生素(OFLX+SMM+SMZ)對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響 OFLX+SMM+SMZ抗生素對(duì)普通小球藻、斜生柵藻生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5。由圖5可看出，低濃度抗生素在培養(yǎng)初期與對(duì)照組變化趨勢(shì)一致且高于對(duì)照組，對(duì)藻類生長(zhǎng)具有良好的促進(jìn)作用，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，聯(lián)合抗生素對(duì)兩種藻類的促進(jìn)作用越來越大，細(xì)胞干重增加越來越快，隨著抗生素濃度的增加，則產(chǎn)生抑制作用，細(xì)胞干重下降，且濃度越大，抑制作用越明顯，相比于兩種抗生素聯(lián)合具有很好的協(xié)同作用， OFLX+SMM+SMZ對(duì)普通小球藻和斜生柵藻生長(zhǎng)均表現(xiàn)出“低促高抑”，表現(xiàn)出顯著地劑量-效應(yīng)的關(guān)系。聯(lián)合抗生素對(duì)普通小球藻的半抑制濃度為10.23 μg/mL，表現(xiàn)為拮抗作用，對(duì)斜生柵的半抑制濃度為7.40 μg/mL，無明顯變化。

圖5 OFLX+SMM+SMZ對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響

取圖5中普通小球藻、斜生柵藻在第96 h的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，擬合所得的普通小球藻和斜生柵藻對(duì)(OFLX+SMM+SMZ)敏感性曲線表達(dá)式分別為公式(10)和公式(11)：

Y=-0.0001X2+0.0009X+0.0508

(10)

(R2=97.28%)

Y=-0.0003X2+0.0022X+0.0466

(11)

(R2=95.79%)

求得聯(lián)合抗生素對(duì)普通小球藻的半抑制濃度為10.23 μg/mL；聯(lián)合抗生素對(duì)斜生柵藻的半抑制濃度為7.40 μg/mL。分析聯(lián)合抗生素對(duì)藻類的半抑制濃度可知，斜生柵藻對(duì)OFLX+SMM+SMZ更為敏感。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)以普通小球藻和斜生柵藻為試驗(yàn)對(duì)象，研究了OFLX、SMM、SMZ 3種抗生素對(duì)兩種綠藻的生長(zhǎng)的影響，探討抗生素對(duì)淡水微藻的作用機(jī)理，得出的結(jié)論為：

(1)OFLX、SMM、SMZ分別對(duì)普通小球藻的半抑制濃度分別為：7.96、6.58、8.19 μg/mL，SMM對(duì)普通小球藻的抑制力最強(qiáng)，敏感程度依次為：SMM>OFLX>SMZ。對(duì)斜生柵藻的半抑制濃度分別為：6.20、7.20、9.89 μg/mL，OFLX對(duì)斜生柵藻的抑制力最強(qiáng)，敏感程度為： OFLX>SMM>SMZ。

(2)當(dāng)OFLX+SMM兩種抗生素聯(lián)合，抑制率小于單一抗生素，其對(duì)普通小球藻的半抑制濃度為8.28 μg/mL,表現(xiàn)為拮抗作用；對(duì)斜生柵藻的半抑制濃度為5.71 μg/mL，表現(xiàn)為協(xié)同作用。當(dāng)OFLX+SMM+SMZ 3種抗生素聯(lián)合，對(duì)普通小球藻的半抑制濃度為10.23 μg/mL,表現(xiàn)為拮抗作用；對(duì)斜生柵藻的半抑制濃度為7.40 μg/mL。

(3)單一及聯(lián)合抗生素均對(duì)綠藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)為“低促高抑”?？股貪舛刃∮诘扔? μg/mL促進(jìn)藻類的生長(zhǎng)，濃度為5 μg/mL時(shí)促進(jìn)作用最為明顯。隨著抗生素濃度增加，產(chǎn)生抑制作用，且OFLX對(duì)普通小球藻的促進(jìn)作用和抑制作用均小于斜生柵藻。相反，SMM和SMZ對(duì)普通小球藻更為敏感。同OFLX一樣，聯(lián)合抗生素均對(duì)斜生柵藻更為敏感。