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亞低溫通過調控內質網(wǎng)應激激活自噬改善蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠早期腦損傷

2018-09-11 07:06:30劉仁杰劉俊杰張堯王婧瑤王一超張婧曦梁文吉趙雅寧李建民
中國醫(yī)科大學學報 2018年9期
關鍵詞:內質網(wǎng)神經(jīng)細胞陽性細胞

劉仁杰,劉俊杰,張堯,王婧瑤,王一超,張婧曦,梁文吉,趙雅寧,李建民

(華北理工大學 1. 附屬醫(yī)院神經(jīng)外科; 2. 臨床醫(yī)學院實驗中心,河北 唐山 063000)

蛛網(wǎng)膜下腔出血 (subarachnoid hemorrhage,SAH) 是一種常見的神經(jīng)外科急癥,致死率、致殘率高,發(fā)病多見于中青年,嚴重威脅人類健康和生命[1]。減輕早期腦損傷是治療的關鍵靶點。內質網(wǎng)應激在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,內質網(wǎng)應激可以抑制神經(jīng)細胞的凋亡,減少神經(jīng)細胞的丟失[2]。自噬可維持細胞自我穩(wěn)態(tài),促進神經(jīng)細胞的存活[3]。并且眾多學者認為內質網(wǎng)應激對自噬的激活有顯著作用[4-5]。目前亞低溫作為一種新型治療方法,通過控制性降低患者核心溫度以保護器官免受損傷影響,在實驗研究及外科手術中得到了廣泛應用,并且在SAH的治療過程中取得了良好的效果[6],但其作用機制目前認識尚不明確。因此,本研究引入內質網(wǎng)應激和自噬,探討亞低溫與內質網(wǎng)應激和自噬的關系,明確亞低溫治療的作用機制,為其應用和推廣提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

成年清潔級雄性SD大鼠 (體質量350~450 g) 48只,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號SCXK (京) 2012-0001。于華北理工大學動物實驗中心適應性飼養(yǎng)2周。采用隨機數(shù)字表法將48只大鼠隨機分成4組,分別為假手術組 (S組,n = 12) 、蛛網(wǎng)膜下腔出血組 (SAH組,n = 12) 、全身亞低溫組(H組,n = 12) 和內質網(wǎng)應激抑制劑組 (TUDCA組,n =12) 。本研究獲得華北理工大學倫理委員會批準。

1.2 試劑及儀器

兔抗Bcclin-1、LC3-Ⅱ一抗,兔抗GRP78、CHOP一抗,購自美國Abcam公司。二抗及其輔助用品,購自博奧森生物技術有限公司。枸櫞酸鹽緩沖液、PBS緩沖液、DAB顯色試劑盒,購自北京中杉金橋生物技術有限公司。820-Ⅱ型切片機,購自德國LEICA公司。TP-1型攤片機、HP-1型烤箱,購自天津天利機電公司。Olympus攝像顯微鏡、Motic 6.0圖像采集及分析系統(tǒng)、BHS顯微鏡,購自日本奧林巴斯公司。電泳儀,購自北京東方儀器廠。電轉槽,購自瑞典Phmarcia公司。

1.3 模型制備及干預方法

如文獻[7]所述,采用頸內動脈穿刺法制備SAH模型。大鼠麻醉后仰臥位,頸正中做切口,逐步分離出頸總、頸外、頸內動脈,結扎、離斷頸外動脈,反轉180°,使之與頸內動脈呈一條直線,在頸外動脈近心斷端打孔,銳化的4-0聚丙烯紡織纖維縫合線引入到右側頸內動脈,推進明顯阻力感后再推3 mm,刺破大腦中動脈與大腦前動脈分叉處。S組操作同模型組,但不刺破血管。

造模成功判定標準:大體標本腦表面散在分布血凝塊;鏡下可見蛛網(wǎng)膜下腔分布大量紅細胞。

H組于造模成功后即刻向大鼠全身噴灑乙醇配合冰浴行體表降溫,將直腸溫度維持在30~32 ℃4 h;TUDCA組于造模前1 h腹腔注射溶于生理鹽水(100 mg/mL) 的?;切苋パ跄懰?(tauroursodesoxycholic acid,TUDCA,內質網(wǎng)應激抑制劑) 溶液,再制備SAH模型。

1.4 HE染色

各組取6只大鼠,于造模成功后24 h將大鼠處死,4%多聚甲醛灌注取腦,常規(guī)石蠟包埋,切片 (片厚5 μ m);梯度乙醇水化,行HE染色,脫水、封片,在光學顯微鏡 (×400) 下觀察結果。每只大鼠海馬CA1區(qū)取6張切片,應用Motic 6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng)觀察每組大鼠 (n = 6) 神經(jīng)細胞形態(tài)變化,計數(shù)單位高倍視野下的存活神經(jīng)細胞數(shù)并計算平均值。

1.5 免疫組化

取上述步驟的石蠟切片,常規(guī)脫蠟水化,用高壓抗原修復2 min,分別滴加GRP78、CHOP、Beclin-1多克隆抗體 (均1∶200稀釋) 、LC3-Ⅱ多克隆抗體(1∶300稀釋) 在濕盒溫育于4 ℃過夜;滴加二抗,37℃溫箱30 min,DAB溶液顯色,鏡下觀察顯色符合要求后,流水終止顯色,梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片。PBS代替一抗進行陰性對照。每只大鼠每個因子 (GRP78、CHOP、Beclin-1以及LC3-Ⅱ) 取出3張切片待測,其中每張切片定位海馬CA1區(qū),隨機抽取5個獨立視野,在Olympus顯微鏡 (×400) 下觀察海馬CA1區(qū)陽性細胞數(shù)量,以胞核、胞質或胞膜呈淺褐色為入選標準。計數(shù)400倍視野下的陽性細胞數(shù)量并計算平均值。

1.6 Western blotting

于造模成功后24 h斷頭,冰上取腦,分離海馬,液氮研磨法進行總蛋白提取,BCA法測定海馬區(qū)蛋白濃度,計算待測品蛋白濃度的上樣量。測定每個因子對應條帶的灰度值,以GAPDH為內參照,應用Image Lab5.0對條帶進行分析,將目標蛋白與GAPDH灰度值的比值作為各因子相對的表達量,分析數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用EXCEL軟件建立數(shù)據(jù)庫,采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Tukey法。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)比較

S組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列整齊,形態(tài)正常,細胞核大而圓,核膜清楚,核仁明顯。SAH組神經(jīng)細胞形態(tài)不規(guī)則,胞核濃縮、溶解,正常神經(jīng)細胞數(shù)量相對減少,差異有統(tǒng)計學意義 (P < 0.05) 。H組較SAH組胞核濃縮現(xiàn)象減輕,存活神經(jīng)細胞數(shù)量明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義 (P < 0.05) 。TUDCA組較SAH組神經(jīng)細胞存活數(shù)量明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.05) 。見圖1、表1。

2.2 各組GRP78和CHOP蛋白表達量比較

免疫組化結果顯示:CHOP蛋白主要表達于胞質,GRP78蛋白主要表達于胞核,陽性細胞胞質中可見大量棕褐色顆粒。與S組相比,SAH組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白陽性細胞數(shù)量增加 (P < 0.05);與SAH組相比,H組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白陽性細胞數(shù)量明顯增加 (P < 0.05);與SAH組相比,TUDCA組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白陽性細胞數(shù)量明顯減少(P < 0.05)。見圖2、表1。

圖1 各組24 h大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)變化 HE×400Fig.1 Neuronal morphology in the hippocampus of rats in each group after 24 hours HE staining×400

表1 各組SAH大鼠海馬區(qū)存活神經(jīng)細胞數(shù)量及GRP78、CHOP、Beclin-1、LC3-Ⅱ表達量的比較Tab.1 Comparison of the number of survival neurons and expression of GRP78,CHOP,Beclin-1,and LC3-Ⅱ in the hippocampus of SAH rats in different groups

Western blotting結果顯示:與S組相比,SAH組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白表達水平升高 (P < 0.05);與SAH組相比,H組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白表達水平明顯升高 (P < 0.05);與SAH組相比,TUDCA組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白表達水平明顯下降 (P <0.05)。見圖3、表1。

圖2 各組24 h大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞GRP78和CHOP的表達 免疫組化染色×400Fig.2 The expression of GRP78 and CHOP proteins in the hippocampal neurons of rats in each group after 24 hours Immunohistochemical staining×400

圖3 各組24 h大鼠海馬GRP78和CHOP蛋白Western blotting檢測結果Fig.3 Western blotting for GRP78 and CHOP proteins in the hippocampus of rats in each group after 24 hours

2.3 各組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達量比較

免疫組化結果顯示:Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白主要表達于細胞質,陽性細胞胞質中可見大量棕褐色顆粒。與S組相比,SAH組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白陽性細胞數(shù)量增加 (P < 0.05);與SAH組相比,H組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白陽性細胞數(shù)量明顯增加(P < 0.05);與SAH組相比,TUDCA組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白陽性細胞數(shù)量明顯減少 (P < 0.05) 。見圖4、表1。

圖4 各組24 h海馬區(qū)神經(jīng)元細胞Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達 免疫組化染色×400Fig.4 The expression of Beclin-1 and LC3-Ⅱ proteins in the hippocampus of rats in each group after 24 hours Immunohistochemical staining×400

Western blotting結果顯示:與S組相比,SAH組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高 (P < 0.05);與SAH組相比,H組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平明顯升高 (P < 0.05);與SAH組相比,TUDCA組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平明顯下降(P < 0.05) 。見圖5、表1。

3 討論

圖5 各組24 h大鼠海馬Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白Western blotting檢測結果Fig.5 Western blotting for Beclin-1 and LC3-Ⅱ proteins in the hippocampus of rats in each group after 24 hours

本研究結果顯示,亞低溫干預后,存活神經(jīng)細胞數(shù)量明顯增加,提示亞低溫干預對SAH后神經(jīng)細胞的死亡可能起到一定的抑制或者延緩作用。研究[8]發(fā)現(xiàn),低溫的腦保護作用是通過降低活性氧自由基、脂質過氧化,降低興奮性谷氨酸活性,從而起到對腦神經(jīng)的保護作用。魏紅艷等[9]發(fā)現(xiàn)亞低溫治療可能在一定程度上減輕血管壁的病理損傷,從而對維持腦供血、減輕因腦缺血造成的神經(jīng)細胞損傷起到改善作用。同時,亞低溫治療可以通過減輕血管痙攣,減輕大鼠神經(jīng)細胞的凋亡,從而起到腦保護的作用。本研究結果與此一致。

本研究結果還發(fā)現(xiàn),SAH大鼠實施亞低溫能夠使GRP78、CHOP蛋白表達增加,提示亞低溫干預可以進一步使內質網(wǎng)應激化。內質網(wǎng)具有極強的內穩(wěn)態(tài)體系,但受到外界因素如缺血再灌注損傷、氧化應激、同型半胱氨酸等多種物理、化學或遺傳因素等作用,均可引發(fā)內質網(wǎng)應激[10]。內質網(wǎng)應激主要包括由3個膜通道蛋白介導的信號通路,即IREl通路、PERK通路、ATF6 通路,在無應激的狀態(tài)下,上述3個膜通道蛋白與GRP78蛋白處于緊密結合狀態(tài)[11]。在受到各種因素刺激下,它們與GRP78發(fā)生分離而被激活,進而引發(fā)一系列細胞因子的表達,在轉錄與表達水平抑制細胞凋亡。RANJAN等[12]研究表明CHOP在內質網(wǎng)應激反應中扮演重要角色,內質網(wǎng)應激反應參與腦缺血后的病理生理反應,而且CHOP在細胞凋亡的過程中起重要作用。CHOP作為內質網(wǎng)應激介導凋亡的特異轉錄因子,在大鼠SAH后,當CHOP表達升高時,GRP78的表達會同樣升高,表明CHOP 可與GRP78同時表達作為保護機制而誘導神經(jīng)細胞凋亡。這與本研究結果一致。因此,亞低溫的保護作用可能和內質網(wǎng)應激存在一定的關系。但是內質網(wǎng)應激是通過何種途徑來實現(xiàn)神經(jīng)保護作用的,目前尚無定論。

本研究發(fā)現(xiàn),亞低溫干預后自噬蛋白表達含量明顯升高,而使用內質網(wǎng)抑制劑后自噬蛋白表達明顯降低;自噬蛋白表達水平與內質網(wǎng)應激程度呈正相關。這提示內質網(wǎng)應激可能與神經(jīng)細胞自噬存在一定的關系,可能通過自噬來發(fā)揮其保護作用。自噬是一個自我分解代謝過程,通過溶酶體來降解細胞成分[13]。適度自噬的激活可以抑制神經(jīng)細胞的凋亡,減少神經(jīng)細胞的丟失[14]。酵母細胞的內質網(wǎng)應激能夠刺激前自噬體的形成和轉運。當錯誤折疊或未折疊蛋白超過了蛋白酶體調節(jié)的降解系統(tǒng),自噬將被觸發(fā),以移除這些蛋白[15]。目前學者[16]認為內質網(wǎng)應激介導自噬的發(fā)生主要依賴于PERK、ATF6和 IRE-1 增加產(chǎn)生的Ca2+。內質網(wǎng)應激產(chǎn)生Ca2+從內質網(wǎng)向細胞質釋放,反過來也可激活各種激酶和蛋白酶,可能參與自噬信號轉導[17]。HCYERHANSEN等[18]研究結果證實Ca2+介導的自噬依賴于鈣調蛋白激酶激酶β,活化蛋白激酶,最終抑制roTOR復合體l而激活自噬。

因此,內質網(wǎng)應激可以激活自噬,自噬又可以通過降解錯誤折疊或未折疊蛋白減輕內質網(wǎng)的負荷,抑制內質網(wǎng)的過度激活[19],同時產(chǎn)生的降解產(chǎn)物也為機體細胞新蛋白質的合成、細胞結構的重建以及ATP的生成提供原料,從而減少SAH后早期腦損傷,起到一定的保護作用。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)通過調控內質網(wǎng)應激激活神經(jīng)細胞自噬,可能是亞低溫療法治療的神經(jīng)保護機制。

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