劉仁杰，劉俊杰，張堯，王婧瑤，王一超，張婧曦，梁文吉，趙雅寧，李建民

（華北理工大學 1. 附屬醫(yī)院神經(jīng)外科； 2. 臨床醫(yī)學院實驗中心，河北 唐山 063000）

蛛網(wǎng)膜下腔出血 （subarachnoid hemorrhage，SAH） 是一種常見的神經(jīng)外科急癥，致死率、致殘率高，發(fā)病多見于中青年，嚴重威脅人類健康和生命［1］。減輕早期腦損傷是治療的關鍵靶點。內質網(wǎng)應激在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，內質網(wǎng)應激可以抑制神經(jīng)細胞的凋亡，減少神經(jīng)細胞的丟失［2］。自噬可維持細胞自我穩(wěn)態(tài)，促進神經(jīng)細胞的存活［3］。并且眾多學者認為內質網(wǎng)應激對自噬的激活有顯著作用［4-5］。目前亞低溫作為一種新型治療方法，通過控制性降低患者核心溫度以保護器官免受損傷影響，在實驗研究及外科手術中得到了廣泛應用，并且在SAH的治療過程中取得了良好的效果［6］，但其作用機制目前認識尚不明確。因此，本研究引入內質網(wǎng)應激和自噬，探討亞低溫與內質網(wǎng)應激和自噬的關系，明確亞低溫治療的作用機制，為其應用和推廣提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

成年清潔級雄性SD大鼠 （體質量350～450 g） 48只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK （京） 2012-0001。于華北理工大學動物實驗中心適應性飼養(yǎng)2周。采用隨機數(shù)字表法將48只大鼠隨機分成4組，分別為假手術組 （S組，n = 12） 、蛛網(wǎng)膜下腔出血組 （SAH組，n = 12） 、全身亞低溫組（H組，n = 12） 和內質網(wǎng)應激抑制劑組 （TUDCA組，n =12） 。本研究獲得華北理工大學倫理委員會批準。

1.2 試劑及儀器

兔抗Bcclin-1、LC3-Ⅱ一抗，兔抗GRP78、CHOP一抗，購自美國Abcam公司。二抗及其輔助用品，購自博奧森生物技術有限公司。枸櫞酸鹽緩沖液、PBS緩沖液、DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。820-Ⅱ型切片機，購自德國LEICA公司。TP-1型攤片機、HP-1型烤箱，購自天津天利機電公司。Olympus攝像顯微鏡、Motic 6.0圖像采集及分析系統(tǒng)、BHS顯微鏡，購自日本奧林巴斯公司。電泳儀，購自北京東方儀器廠。電轉槽，購自瑞典Phmarcia公司。

1.3 模型制備及干預方法

如文獻［7］所述，采用頸內動脈穿刺法制備SAH模型。大鼠麻醉后仰臥位，頸正中做切口，逐步分離出頸總、頸外、頸內動脈，結扎、離斷頸外動脈，反轉180°，使之與頸內動脈呈一條直線，在頸外動脈近心斷端打孔，銳化的4-0聚丙烯紡織纖維縫合線引入到右側頸內動脈，推進明顯阻力感后再推3 mm，刺破大腦中動脈與大腦前動脈分叉處。S組操作同模型組，但不刺破血管。

造模成功判定標準：大體標本腦表面散在分布血凝塊；鏡下可見蛛網(wǎng)膜下腔分布大量紅細胞。

H組于造模成功后即刻向大鼠全身噴灑乙醇配合冰浴行體表降溫，將直腸溫度維持在30～32 ℃4 h；TUDCA組于造模前1 h腹腔注射溶于生理鹽水（100 mg/mL） 的?；切苋パ跄懰?（tauroursodesoxycholic acid，TUDCA，內質網(wǎng)應激抑制劑） 溶液，再制備SAH模型。

1.4 HE染色

各組取6只大鼠，于造模成功后24 h將大鼠處死，4%多聚甲醛灌注取腦，常規(guī)石蠟包埋，切片 （片厚5 μ m）；梯度乙醇水化，行HE染色，脫水、封片，在光學顯微鏡 （×400） 下觀察結果。每只大鼠海馬CA1區(qū)取6張切片，應用Motic 6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng)觀察每組大鼠 （n = 6） 神經(jīng)細胞形態(tài)變化，計數(shù)單位高倍視野下的存活神經(jīng)細胞數(shù)并計算平均值。

1.5 免疫組化

取上述步驟的石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，用高壓抗原修復2 min，分別滴加GRP78、CHOP、Beclin-1多克隆抗體 （均1∶200稀釋） 、LC3-Ⅱ多克隆抗體（1∶300稀釋） 在濕盒溫育于4 ℃過夜；滴加二抗，37℃溫箱30 min，DAB溶液顯色，鏡下觀察顯色符合要求后，流水終止顯色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片。PBS代替一抗進行陰性對照。每只大鼠每個因子 （GRP78、CHOP、Beclin-1以及LC3-Ⅱ） 取出3張切片待測，其中每張切片定位海馬CA1區(qū)，隨機抽取5個獨立視野，在Olympus顯微鏡 （×400） 下觀察海馬CA1區(qū)陽性細胞數(shù)量，以胞核、胞質或胞膜呈淺褐色為入選標準。計數(shù)400倍視野下的陽性細胞數(shù)量并計算平均值。

1.6 Western blotting

于造模成功后24 h斷頭，冰上取腦，分離海馬，液氮研磨法進行總蛋白提取，BCA法測定海馬區(qū)蛋白濃度，計算待測品蛋白濃度的上樣量。測定每個因子對應條帶的灰度值，以GAPDH為內參照，應用Image Lab5.0對條帶進行分析，將目標蛋白與GAPDH灰度值的比值作為各因子相對的表達量，分析數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用EXCEL軟件建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey法。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)比較

S組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)正常，細胞核大而圓，核膜清楚，核仁明顯。SAH組神經(jīng)細胞形態(tài)不規(guī)則，胞核濃縮、溶解，正常神經(jīng)細胞數(shù)量相對減少，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） 。H組較SAH組胞核濃縮現(xiàn)象減輕，存活神經(jīng)細胞數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） 。TUDCA組較SAH組神經(jīng)細胞存活數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05） 。見圖1、表1。

2.2 各組GRP78和CHOP蛋白表達量比較

免疫組化結果顯示：CHOP蛋白主要表達于胞質，GRP78蛋白主要表達于胞核，陽性細胞胞質中可見大量棕褐色顆粒。與S組相比，SAH組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白陽性細胞數(shù)量增加 （P ＜ 0.05）；與SAH組相比，H組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白陽性細胞數(shù)量明顯增加 （P ＜ 0.05）；與SAH組相比，TUDCA組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白陽性細胞數(shù)量明顯減少（P ＜ 0.05）。見圖2、表1。

圖1 各組24 h大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)變化 HE×400Fig.1 Neuronal morphology in the hippocampus of rats in each group after 24 hours HE staining×400

表1 各組SAH大鼠海馬區(qū)存活神經(jīng)細胞數(shù)量及GRP78、CHOP、Beclin-1、LC3-Ⅱ表達量的比較Tab.1 Comparison of the number of survival neurons and expression of GRP78，CHOP，Beclin-1，and LC3-Ⅱ in the hippocampus of SAH rats in different groups

Western blotting結果顯示：與S組相比，SAH組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白表達水平升高 （P ＜ 0.05）；與SAH組相比，H組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白表達水平明顯升高 （P ＜ 0.05）；與SAH組相比，TUDCA組海馬區(qū)GRP78、CHOP蛋白表達水平明顯下降 （P ＜0.05）。見圖3、表1。

圖2 各組24 h大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞GRP78和CHOP的表達 免疫組化染色×400Fig.2 The expression of GRP78 and CHOP proteins in the hippocampal neurons of rats in each group after 24 hours Immunohistochemical staining×400

圖3 各組24 h大鼠海馬GRP78和CHOP蛋白Western blotting檢測結果Fig.3 Western blotting for GRP78 and CHOP proteins in the hippocampus of rats in each group after 24 hours

2.3 各組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達量比較

免疫組化結果顯示：Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白主要表達于細胞質，陽性細胞胞質中可見大量棕褐色顆粒。與S組相比，SAH組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白陽性細胞數(shù)量增加 （P ＜ 0.05）；與SAH組相比，H組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白陽性細胞數(shù)量明顯增加（P ＜ 0.05）；與SAH組相比，TUDCA組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白陽性細胞數(shù)量明顯減少 （P ＜ 0.05） 。見圖4、表1。

圖4 各組24 h海馬區(qū)神經(jīng)元細胞Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達 免疫組化染色×400Fig.4 The expression of Beclin-1 and LC3-Ⅱ proteins in the hippocampus of rats in each group after 24 hours Immunohistochemical staining×400

Western blotting結果顯示：與S組相比，SAH組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高 （P ＜ 0.05）；與SAH組相比，H組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平明顯升高 （P ＜ 0.05）；與SAH組相比，TUDCA組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平明顯下降（P ＜ 0.05） 。見圖5、表1。

3 討論

圖5 各組24 h大鼠海馬Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白Western blotting檢測結果Fig.5 Western blotting for Beclin-1 and LC3-Ⅱ proteins in the hippocampus of rats in each group after 24 hours

本研究結果顯示，亞低溫干預后，存活神經(jīng)細胞數(shù)量明顯增加，提示亞低溫干預對SAH后神經(jīng)細胞的死亡可能起到一定的抑制或者延緩作用。研究［8］發(fā)現(xiàn)，低溫的腦保護作用是通過降低活性氧自由基、脂質過氧化，降低興奮性谷氨酸活性，從而起到對腦神經(jīng)的保護作用。魏紅艷等［9］發(fā)現(xiàn)亞低溫治療可能在一定程度上減輕血管壁的病理損傷，從而對維持腦供血、減輕因腦缺血造成的神經(jīng)細胞損傷起到改善作用。同時，亞低溫治療可以通過減輕血管痙攣，減輕大鼠神經(jīng)細胞的凋亡，從而起到腦保護的作用。本研究結果與此一致。

本研究結果還發(fā)現(xiàn)，SAH大鼠實施亞低溫能夠使GRP78、CHOP蛋白表達增加，提示亞低溫干預可以進一步使內質網(wǎng)應激化。內質網(wǎng)具有極強的內穩(wěn)態(tài)體系，但受到外界因素如缺血再灌注損傷、氧化應激、同型半胱氨酸等多種物理、化學或遺傳因素等作用，均可引發(fā)內質網(wǎng)應激［10］。內質網(wǎng)應激主要包括由3個膜通道蛋白介導的信號通路，即IREl通路、PERK通路、ATF6 通路，在無應激的狀態(tài)下，上述3個膜通道蛋白與GRP78蛋白處于緊密結合狀態(tài)［11］。在受到各種因素刺激下，它們與GRP78發(fā)生分離而被激活，進而引發(fā)一系列細胞因子的表達，在轉錄與表達水平抑制細胞凋亡。RANJAN等［12］研究表明CHOP在內質網(wǎng)應激反應中扮演重要角色，內質網(wǎng)應激反應參與腦缺血后的病理生理反應，而且CHOP在細胞凋亡的過程中起重要作用。CHOP作為內質網(wǎng)應激介導凋亡的特異轉錄因子，在大鼠SAH后，當CHOP表達升高時，GRP78的表達會同樣升高，表明CHOP 可與GRP78同時表達作為保護機制而誘導神經(jīng)細胞凋亡。這與本研究結果一致。因此，亞低溫的保護作用可能和內質網(wǎng)應激存在一定的關系。但是內質網(wǎng)應激是通過何種途徑來實現(xiàn)神經(jīng)保護作用的，目前尚無定論。

本研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫干預后自噬蛋白表達含量明顯升高，而使用內質網(wǎng)抑制劑后自噬蛋白表達明顯降低；自噬蛋白表達水平與內質網(wǎng)應激程度呈正相關。這提示內質網(wǎng)應激可能與神經(jīng)細胞自噬存在一定的關系，可能通過自噬來發(fā)揮其保護作用。自噬是一個自我分解代謝過程，通過溶酶體來降解細胞成分［13］。適度自噬的激活可以抑制神經(jīng)細胞的凋亡，減少神經(jīng)細胞的丟失［14］。酵母細胞的內質網(wǎng)應激能夠刺激前自噬體的形成和轉運。當錯誤折疊或未折疊蛋白超過了蛋白酶體調節(jié)的降解系統(tǒng)，自噬將被觸發(fā)，以移除這些蛋白［15］。目前學者［16］認為內質網(wǎng)應激介導自噬的發(fā)生主要依賴于PERK、ATF6和 IRE-1 增加產(chǎn)生的Ca2+。內質網(wǎng)應激產(chǎn)生Ca2+從內質網(wǎng)向細胞質釋放，反過來也可激活各種激酶和蛋白酶，可能參與自噬信號轉導［17］。HCYERHANSEN等［18］研究結果證實Ca2+介導的自噬依賴于鈣調蛋白激酶激酶β，活化蛋白激酶，最終抑制roTOR復合體l而激活自噬。

因此，內質網(wǎng)應激可以激活自噬，自噬又可以通過降解錯誤折疊或未折疊蛋白減輕內質網(wǎng)的負荷，抑制內質網(wǎng)的過度激活［19］，同時產(chǎn)生的降解產(chǎn)物也為機體細胞新蛋白質的合成、細胞結構的重建以及ATP的生成提供原料，從而減少SAH后早期腦損傷，起到一定的保護作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)通過調控內質網(wǎng)應激激活神經(jīng)細胞自噬，可能是亞低溫療法治療的神經(jīng)保護機制。