熊良偉 王帥兵 岳麗佳 王建國 陶桂慶 徐亮 王權(quán)

摘要：【目的】分析寬體金線蛭基因組SSR序列特征，并開發(fā)多態(tài)性SSR分子標(biāo)記，為寬體金線蛭種質(zhì)遺傳多樣性分析及良種選育等提供有效的分子標(biāo)記?！痉椒ā坷没蚪Mde novo測序技術(shù)對寬體金線蛭基因組進(jìn)行掃描，通過序列拼接得到基因組序列，利用Tandem Repeats Finder v4.09查找拼接序列SSR位點(diǎn)，分析SSR序列特征并使用PRIMER3 Input（version 2.3.7）設(shè)計(jì)引物，隨機(jī)選擇三堿基、四堿基和五堿基SSR分子標(biāo)記引物50對對8份寬體金線蛭DNA樣品進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并以多態(tài)性SSR分子標(biāo)記分析寬體金線蛭江蘇高郵群體遺傳多樣性?！窘Y(jié)果】測序拼接共得到148803個scaffolds序列，scaffold序列長度181～564229 bp，平均1544 bp，總長度230 Mb，N50為5948 bp，GC含量36.94%。寬體金線蛭基因組中三堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)最多，有136890個，占總SSR位點(diǎn)的68.43%;其次為四堿基重復(fù)，有33769個，占總SSR位點(diǎn)的16.88%;六堿基、五堿基、二堿基和單堿基重復(fù)分別有11813、7110、6546和3907個，占總SSR位點(diǎn)的5.91%、3.55%、3.27%和1.95%?；?yàn)锳AT/ATA/TAA/ATT/TTA/TAT的SSR位點(diǎn)數(shù)量最多，其次為ATG/TGA/GAT/TAC/ACT/CTA、AGT/GTA/TAG/TCA/CAT/ATC和AAC/ACA/CAA/TTG/TGT/GTT，其他基序位點(diǎn)數(shù)量較少。有11871個SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)出引物，占總SSR位點(diǎn)的5.93%;選擇的50對引物中有18對引物在8份寬體金線蛭DNA樣品中具有多態(tài)性;群體遺傳多樣性檢測發(fā)現(xiàn)寬體金線蛭江蘇高郵群體18個SSR位點(diǎn)的平均等位基因（Na）3.81個，觀測雜合度（HO）為0.0000～0.6429，平均為0.3631，期望雜合度（He）0.0701～0.7792，平均為0.4869，群體遺傳多樣性水平低?！窘Y(jié)論】采用高通量測序技術(shù)開發(fā)SSR分子標(biāo)記效率高，且新開發(fā)的18個寬體金線蛭SSR分子標(biāo)記多態(tài)性豐富，可用于寬體金線蛭資源保護(hù)和利用。

關(guān)鍵詞： 寬體金線蛭;基因組;de novo測序;SSR分子標(biāo)記;遺傳多樣性

中圖分類號： S966.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）11-2298-06

SSR sequence characters for genome of Whitmania pigra Whitman and development of molecular markers

XIONG Liang-wei1， WANG Shuai-bing1， YUE Li-jia1， WANG Jian-guo1，

TAO Gui-qing2， XU Liang3， Wang Quan1*

（1Department of Aquatic Science and Technology， Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College， Taizhou， Jiangsu 225300， China; 2Jingjiang Mingxing Leech Science & Technology Co.， Ltd.， Jingjiang， Jiangsu? 214500， China;

3Taizhou Haiwei Agricultural Science and Technology Development Co.， Ltd.， Taizhou， Jiangsu? 225300， China）

Abstract：【Objective】In order to provide the appropriate molecular markers for assessment of germplasm genetic diversity and fine species breeding of Whitmania pigra Whitman， the characteristics of SSR sequence of the genome were analyzed and new polymorphic SSR molecular markers were developed. 【Method】W. pigra was used for a genomic do novo sequencing by scanning. Then the genomic sequences were assembled， and SSR loci were identified from the assembled sequences using Tandem Repeats Finder（version 4.09）. The characteristics of the SSR sequence were analyzed and the primers were designed using PRIMER3 Input（version 2.3.7）. A subset of 50 primer pairs with the motif of tri-， tetra- and penta-nucleotide was randomly selected for PCR test using the genomic DNA of a panel of eight individuals of W. pigra. The polymorphic SSR molecular markers were used for genetic diversity analysis of Gaoyou population in Jiangsu Pro-vince. 【Result】A total of 230 Mb of sequence data were obtained from 148803 scaffolds sequences with a length range from 181 bp to 564229 bp. The average length of the scaffolds was 1544 bp， and the N50 was 5948 bp. The content of GC was 36.94%. The most abundant repeat SSR loci in W. pigra genome was tri-nucleotide with the number of 136890， accounting for 68.43% of the total number， followed by tetra-nucleotide 33769（16.88%）. And hexa-nucleotide 11813（5.91%）， penta-nucleotide 7110（3.55%）， di-nucleotide 6546（3.27%） and mono-nucleotide 3907（1.95%） repeat units were also observed. The motif with the most frequent SSR loci were AAT/ATA/TAA/ATT/TTA/TAT motifs， followed by ATG/TGA/GAT/TAC/ACT/CTA motifs， AGT/GTA/TAG/TCA/CAT/ATC motifs and AAC/ACA/CAA/TTG/TGT/ GTT motifs， while the others were comparatively scarce. A total of 11871 SSR loci designed primers， which accounted for 5.93% of the total SSR loci. Eighteen primer pairs out of the 50 primer pairs presented polymorphism in W. pigra DNA samples. In a population genetic diversity analysis of individuals from Gaoyou County， Jiangsu Province with the 18 primer pairs， the average number of alleles per locus（Na） was 3.81. The observed heterozygosities（Ho） ranged from 0.0000 to 0.6429，with a mean value of 0.3631， the expected heterozygo stities（He） was 0.0701-0.7792 with an average of 0.4869， indicating a low level of genetic diversity. 【Conclusion】The method to develop SSR molecular markers through high-throughput sequencing is efficient. The 18 developed SSR molecular markers of W. pigra are polymorphic， which will be useful in conservation and management of W. pigra resources.

Key words： Whitmania pigra Whitman; genome; de novo sequencing; SSR molecular marker; genetic diversity

0 引言

【研究意義】寬體金線蛭（Whitmania pigra Whitman）俗稱螞蟥，是《中國藥典》藥材水蛭的主要基原動物，其干燥后可全體入藥，具有破血通經(jīng)、逐瘀消癥的功效（郭坤等，2017），是當(dāng)前人類心腦血管疾病防治藥物的主要原料。由于寬體金線蛭具有較高的藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值，其市場銷售供不應(yīng)求，進(jìn)而推動寬體金線蛭人工養(yǎng)殖迅速發(fā)展，現(xiàn)已成為江蘇、湖北、安徽等地的特色產(chǎn)業(yè)（劉飛和楊大堅(jiān)，2014）。在人工養(yǎng)殖過程中，繁殖親蛭需每年3—4月從天然水體中捕獲，不同來源地的親蛭混雜嚴(yán)重，且寬體金線蛭野生資源遭到破壞，種質(zhì)污染風(fēng)險高，因此迫切需要開展寬體金線蛭種質(zhì)資源保護(hù)工作?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，關(guān)于寬體金線蛭的研究主要集中在人工繁殖和養(yǎng)殖方面（熊良偉等，2016，2017;戴道新等，2017;郭坤等，2017）;由于缺乏有效的分子標(biāo)記，針對寬體金線蛭種質(zhì)遺傳多樣性和分子標(biāo)記輔助育種的研究甚少。微衛(wèi)星又稱簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR），是一種共顯性分子標(biāo)記，具有操作簡單、重復(fù)性好、多態(tài)性高等特點(diǎn)，在種質(zhì)遺傳多樣性分析、親權(quán)分析、遺傳圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用（Zhang et al.，2006;趙志英等，2018），但SSR分子標(biāo)記具有種質(zhì)特異性，應(yīng)用前需進(jìn)行開發(fā)。采用傳統(tǒng)磁珠富集法開發(fā)SSR分子標(biāo)記效率低且成本高（Zane et al.，2002），而利用高通量測序技術(shù)開發(fā)SSR分子標(biāo)記能極大提高開發(fā)效率，并有效降低成本，已成功應(yīng)用于二長棘鯛（Parargyrops edita）（楊兵等，2015）、青石斑魚（Epinephelus awoara）（高峰濤等，2017）、曼氏無針烏賊（Sepiella japonica）（呂振明等，2017）、中華鳑鲏（Rhodeus sinensis）（Xiong et al.，2017）等非模式動物的SSR分子標(biāo)記開發(fā)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，尚無利用高通量測序技術(shù)開發(fā)寬體金線蛭SSR分子標(biāo)記的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過基因組de novo測序技術(shù)對寬體金線蛭基因組進(jìn)行掃描，查找出SSR位點(diǎn)，并分析其SSR序列特征及開發(fā)多態(tài)性SSR分子標(biāo)記，為寬體金線蛭種質(zhì)遺傳多樣性分析和良種選育等提供有效的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1. 1 樣本采集

2017年3月從江蘇省高郵地區(qū)收集性成熟寬體金線蛭28尾，體重21.45±5.91 g/尾，經(jīng)江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院熊良偉博士鑒定為W. pigra。取寬體金線蛭體側(cè)壁肌肉為組織樣品，采用苯酚—氯仿法抽提其基因組DNA，再分別以瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測DNA的完整性及其濃度。檢測合格后隨機(jī)挑選一份寬體金線蛭DNA樣品送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行基因組de novo測序。

1. 2 基因組de novo測序與序列拼接

使用NEBNext? UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒構(gòu)建DNA文庫，具體操作：選取2 ?g基因組DNA用超聲波破碎儀（Covaris S220）隨機(jī)打斷成小于500 bp的片段，通過End Prep Enzyme Mix進(jìn)行粘性末端修復(fù)（包括5'末端磷酸化和3'端加堿基A），兩端加測序接頭后使用AxyPrep Mag PCR Clean-up純化410 bp左右的片段，用引物P5（5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3'）和P7（5'-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'）進(jìn)行擴(kuò)增，然后以Agilent 2100生物分析儀（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）和Qubit 2.0熒光光度計(jì)（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分別檢測DNA文庫的質(zhì)量和濃度。

DNA文庫建好后，按Illumina HiSeq（Illumina，San Diego，CA，USA）儀器使用說明進(jìn)行2*300 bp雙端測序，由HiSeq自帶的HiSeq Control Software （HCS）+OLB+GAPipeline-1.6讀取序列信息。測序結(jié)果（原始圖像數(shù)據(jù)）利用bcl2fastq v2.17.1.14進(jìn)行圖像堿基識別，經(jīng)初步質(zhì)量分析后得到測序樣本的原始數(shù)據(jù);以Cutadapt v1.9.1對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化處理：①去除引物及接頭序列;②去除兩端質(zhì)量值低于20的堿基;③去除含N比例高于10%的原始序列;④去除長度小于75 bp的序列。基于優(yōu)化后的數(shù)據(jù)，以Velvet 1.2.10拼接出分段的contig序列，再用SSPACE v3.0將contig序列進(jìn)一步組裝得到scaffold序列，最后采用GapFiller（version 1-10）將scaffold序列延伸得到N比例較低、序列較長的scaffold序列。

1. 3 SSR位點(diǎn)查找及引物設(shè)計(jì)

采用Tandem Repeats Finder v4.09查找拼接序列SSR位點(diǎn)（Benson，1999），查找位點(diǎn)包括單堿基～六堿基重復(fù)，且要求單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基和六堿基最少重復(fù)次數(shù)分別為13、6、5、5、5和5次。使用PRIMER3 Input（version 2.3.7）對查找到的SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物（Untergasser et al.，2012），主要設(shè)計(jì)參數(shù)：退火溫度（Tm）57～63 ℃，上、下游引物Tm相差小于5 ℃;擴(kuò)增產(chǎn)物大小100～280 bp;擴(kuò)增引物長度18～27 bp，GC含量40.00%～65.00%。

1. 4 PCR檢測

隨機(jī)挑選三堿基、四堿基和五堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)引物50對，用8份寬體金線蛭DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，檢測其擴(kuò)增效果。PCR反應(yīng)體系10.0 ?L，其中DNA模板（10.0 ng/?L）1.0 ?L，正、反向引物（10.0 ?mol/L）各0.5 ?L，2×Taq PCR Master Mix 5.0 ?L，雙蒸水3.0 ?L。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 45 s，退火45 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行30個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物以6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，參照楊兵等（2015）的方法進(jìn)行銀染及顯色，最后將膠片平鋪到觀片燈上用數(shù)碼相機(jī)拍照保存。

1. 5 群體遺傳多樣性分析

選擇擴(kuò)增條帶清晰且呈多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記檢測寬體金線蛭江蘇高郵群體遺傳多樣性，PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同1.4。根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶位置確定每個樣品各SSR位點(diǎn)的基因型，用Micro-Checker 2.2.3分析各SSR位點(diǎn)是否存在無效等位基因（Van Oosterhout et al.，2010），以PopGen32分析群體各位點(diǎn)的等位基因數(shù)（Na）、觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He），并采用Genepop 4.0進(jìn)行哈代—溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）檢驗(yàn)和連鎖不平衡（Linkage disequilibrium，LD）分析（Rousset，2008）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 基因組測序拼接結(jié)果

寬體金線蛭的de novo測序共獲得48988112個原始序列，序列平均長度300 bp，共有堿基1470 Mb，堿基GC含量38.44%，Q30為79.03%。原始序列經(jīng)優(yōu)化處理后，Q30為93.43%，大于75.00%，說明測序質(zhì)量良好，可用于拼接。拼接結(jié)果顯示，共獲得148803個scaffolds序列，scaffold序列長度181～564229 bp，平均1544 bp;scaffold序列總長230 Mb，N50為5948 bp，GC含量36.94%。

2. 2 基因組SSR序列特征分析結(jié)果

在拼接的scaffold序列中共查找到200035個SSR位點(diǎn)，單堿基～六堿基重復(fù)序列均有存在，但不同堿基數(shù)量重復(fù)類型數(shù)量存在明顯差異（圖1）。其中，三堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)最多，有136890個，占總SSR位點(diǎn)的68.43%;其次為四堿基重復(fù)，有33769個，占總SSR位點(diǎn)的16.88%;六堿基、五堿基、二堿基、單堿基重復(fù)分別有11813、7110、6546和3907個，占總SSR位點(diǎn)的5.91%、3.55%、3.27%和1.95%。由圖1還可看出，不同堿基類型重復(fù)位點(diǎn)數(shù)量也不一樣，寬體金線蛭基因組中AAT/ATA/TAA/ATT/TTA/TAT的重復(fù)數(shù)量最多，其次為ATG/TGA/GAT/TAC/ACT/CTA、AGT/GTA/TAG/TCA/CAT/ATC和AAC/ACA/CAA/ TTG/TGT/GTT，其他重復(fù)類型相對較少。

2. 3 SSR位點(diǎn)的PCR驗(yàn)證結(jié)果

查找到的SSR位點(diǎn)中共有11871個位點(diǎn)設(shè)計(jì)出引物，占總SSR位點(diǎn)的5.93%。在選取的50對引物中，有8對引物（占16.00%）無任何擴(kuò)增產(chǎn)物;有4對引物（占8.00%）的擴(kuò)增片段復(fù)雜，如圖2中的WP42位點(diǎn);其余38對引物（占76.00%）有清晰擴(kuò)增產(chǎn)物，且擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相符，如圖2中的WP39、WP40和WP41位點(diǎn)，但有20對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物不具多態(tài)性，如圖2中的WP41和WP43位點(diǎn)。

2. 4 群體遺傳多樣性分析結(jié)果

18對多態(tài)性引物從寬體金線蛭群體（28份樣品）中擴(kuò)增出的條帶多態(tài)性較豐富，每個SSR位點(diǎn)檢測到等位基因2～7個，平均3.81個。圖3為WP54和WP59位點(diǎn)在寬體金線蛭群體樣品中的擴(kuò)增結(jié)果。檢測寬體金線蛭群體的Ho為0.0000～0.6429，平均為0.3631;He為0.0701～0.7792，平均為0.4869（表1）。其中，WP3、WP7、WP20和WP48 4個SSR位點(diǎn)檢測發(fā)現(xiàn)存在無效等位基因。HWE檢驗(yàn)結(jié)果顯示，有4個SSR位點(diǎn)（WP3、WP7、WP20和WP48）顯著偏離平衡（P<0.05）;而LD分析結(jié)果表明，WP23和WP54位點(diǎn)間存在連鎖關(guān)系（P<0.05）。

3 討論

SSR分子標(biāo)記的傳統(tǒng)開發(fā)方法是先通過富集得到含SSR基因組片段，經(jīng)測序分析后合成引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證（Zane et al.，2002），但由于對開發(fā)物種基因組缺乏了解，富集文庫具有盲目性，且富集得到的DNA片段長度有限，部分SSR位點(diǎn)無法設(shè)計(jì)出引物，導(dǎo)致開發(fā)效率低、成本高。Liu等（2013）利用富集法和SAMPL法共開發(fā)獲得寬體金線蛭SSR標(biāo)記14個，其中三堿基重復(fù)類型1個，其余均為二堿基重復(fù)。本研究利用高通量測序技術(shù)開發(fā)出11871條寬體金線蛭候選SSR分子標(biāo)記，包括單堿基～六堿基重復(fù)類型，開發(fā)效率較高，從50個候選標(biāo)記中開發(fā)出18個三堿基～五堿基重復(fù)的多態(tài)性SSR分子標(biāo)記，新開發(fā)標(biāo)記基序更長，可有效提高寬體金線蛭個體SSR分子標(biāo)記分型準(zhǔn)確性。

水蛭作為一種非模式生物，對其基因組信息了解甚少。Simakov等（2013）為了闡明兩側(cè)對稱動物的進(jìn)化關(guān)系，對加利福尼亞蛭（Helobdella robusta）、海蠕蟲（Capitella teleta）和青貝（Lottia gigantea）3種動物基因組進(jìn)行測序、拼裝和注釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加利福尼亞蛭基因組相對較小，僅228 Mb，GC含量33.00%，該結(jié)論為其他蛭類基因組學(xué)研究提供了重要參考。本研究對寬體金線蛭基因組進(jìn)行de novo測序和拼接，原始序列經(jīng)過優(yōu)化處理后Q30達(dá)93.43%，測序質(zhì)量高，拼接后序列GC含量36.94%，長度為230 Mb，與加利福尼亞蛭的GC含量和基因組大小相近，即本研究開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記能完全體現(xiàn)寬體金線蛭基因SSR信息特征。

曾曉蕓等（2015）研究表明，裸體異鰾鰍鮀（Xe-nophysogobio nudicorpa）基因組中二堿基重復(fù)占總SSR位點(diǎn)的83.15%，三堿基重復(fù)占總SSR位點(diǎn)的14.05%;倪守勝等（2018）研究表明，蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）基因組中二堿基和三堿基重復(fù)占總SSR位點(diǎn)的比例較高，分別為37.05%和45.17%，表明不同水產(chǎn)動物基因組SSR類型存在明顯差異。本研究結(jié)果顯示，寬體金線蛭基因組SSR位點(diǎn)以三堿基重復(fù)序列為主，占總SSR位點(diǎn)68.43%，單堿基和二堿基重復(fù)序列較少，占總SSR位點(diǎn)的比例均在5.00%以下。王斌等（2017）通過對棒紋牛蛭（Poecilobdella javanica）、日本醫(yī)蛭（Hirudo nipponia）、寬體金線蛭和洞穴山蛭（Heamadipsa cavatuses sp.nov.）4種蛭類進(jìn)行RNA測序和轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)三堿基重復(fù)序列占各種蛭類SSR位點(diǎn)類型的47.00%以上，其中寬體金線蛭三堿基重復(fù)序列達(dá)68.00%。該結(jié)論在本研中得到進(jìn)一步證實(shí)，即寬體金線蛭基因組和EST序列中三堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)中基序?yàn)锳AT/ATA/TAA/ATT/TTA/TAT的SSR位點(diǎn)比例最高。

Liu等（2016）利用SSR和TRAP分子標(biāo)記對我國江蘇和浙江等11個區(qū)域野生寬體金線蛭群體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)野生群體遺傳多樣性水平較低，但種群間存在較高水平的遺傳分化。本研究選擇50對SSR引物在8份寬體金線蛭DNA樣品中進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有38對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相符，且條帶型清晰，但僅有18個SSR位點(diǎn)具有多態(tài)性，群體遺傳多樣性檢測發(fā)現(xiàn)寬體金線蛭江蘇高郵群體18個SSR位點(diǎn)的平均等位基因3.81個，平均Ho和He分別為0.3631和0.4869，說明寬體金線蛭江蘇高郵群體遺傳多樣性水平較低，也提示開展寬體金線蛭地方種群保護(hù)十分必要。

4 結(jié)論

采用高通量測序技術(shù)開發(fā)SSR分子標(biāo)記效率高，且新開發(fā)的18個寬體金線蛭SSR分子標(biāo)記多態(tài)性豐富，可用于寬體金線蛭資源保護(hù)和利用。

參考文獻(xiàn)：

戴道新，郭巧生，史紅專，王嘉，盧鑫. 2017. 不同光質(zhì)對螞蟥生長和內(nèi)在品質(zhì)影響的研究[J]. 中國中藥雜志，42（20）：3886-3890. [Dai D X，Guo Q S，Shi H Z，Wang J，Lu X. 2017. Effects of light quality on growth and internal quality of Whitmania pigra[J]. China Journal of Chinese Materia Medica，42（20）：3886-3890.]

高峰濤，邵長偉，崔忠凱，王升鵬，魏敏，陳松林，楊官品. 2017. 基于高通量測序的青石斑魚基因組微衛(wèi)星開發(fā)及評價[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，47（4）：52-57. [Gao F T，Shao C W，Cui Z K，Wang S P，Wei M，Chen S L，Yang G P. 2017. Development and population genetic diversity ana-lysis of microsatellite markers in Epinephelus awoara[J]. Periodical of Ocean University of China，47（4）：52-57.]

郭坤，羅鳴鐘，蘇應(yīng)兵，田進(jìn)松，覃鑄，王成. 2017. 土壤濕度及稻草基質(zhì)對寬體金線蛭繁殖性能的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，48（10）：1918-1922. [Guo K，Luo M Z，Su Y B，Tian J S，Qin Z，Wang C. 2017. Effects of soil water content and straw substrate on reproductive performance of Whitmania pigra[J]. Journal of Southern Agriculture，48（10）：1918-1922.]

劉飛，楊大堅(jiān). 2014. 中國水蛭人工養(yǎng)殖的現(xiàn)行模式調(diào)研[J]. 世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化，16（10）：2170-2173. [Liu F，Yang D J. 2014. Study on artificial breeding model of medical leech in China[J]. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology，16（10）：2170-2173.]

呂振明，侯龍，龔理，劉立芹，陳永久，郭寶英，董迎輝，吳常文. 2017. 基于de novo高通量測序的曼氏無針烏賊（Sepiella japonica）ESTs中微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選與特征分析[J]. 海洋與湖沼，48（4）：877-883. [Lü Z M，Hou L，Gong L，Liu L Q，Chen Y J，Guo B Y，Dong Y H，Wu C W. 2017. Isolation and analysis on EST microsatellites of Sepiella japonica by de novo high-throughput transcriptome sequencing[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica，48（4）：877-883.]

倪守勝，楊鈺，柳淑芳，莊志猛. 2018. 基于高通量測序的蝦夷扇貝基因組微衛(wèi)星特征分析[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，39（1）：107-113. [Ni S S，Yang Y，Liu S F，Zhuang Z M. 2018. Microsatellite analysis of Patinopecten yessoensis using next-generation sequencing method[J]. Progress in Fishery Sciences，39（1）：107-113.]

王斌，孫靜，劉凌云，喬永鋒，程霞，仝向榮，王德斌. 2017. 蛭類轉(zhuǎn)錄組中EST-SSR分析及抗凝血相關(guān)分子標(biāo)記的挖掘[J]. 中草藥，48（1）：172-178. [Wang B，Sun J，Liu L Y，Qiao Y F，Cheng X，Tong X R，Wang D B. 2017. Analysis on EST-SSR in transcriptome of medicinal leeches and mining of anticoagulant related functional molecular markers[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，48（1）：172-178.]

熊良偉，王建國，王帥兵，王權(quán)，吳云菲，陶桂慶，侯君. 2017. 寬體金線蛭選育群體生產(chǎn)性狀的選擇效應(yīng)[J]. 中藥材，40（6）：1249-1252. [Xiong L W，Wang J G，Wang S B，Wang Q，Wu Y F，Tao G Q，Hou J. 2017. Preliminary evaluation for the production traits of mass selective breeding population of Whitmania pigra[J]. Journal of Chinese Medicinal Materials，40（6）：1249-1252.]

熊良偉，王帥兵，王建國，封琦，陶桂慶，李明，邵文秋，侯君，王權(quán). 2016. 寬體金線蛭繁殖性能及蛭苗生長特征研究[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，25（3）：374-380. [Xiong L W，Wang S B，Wang J G，F(xiàn)eng Q，Tao G Q，Li M，Shao W Q，Hou J，Wang Q. 2016. Study on reproductive ability and growth traits of the Whitmania pigra Whitman[J]. Journal of Shanghai Ocean University，25（3）：374-380.]

楊兵，林琳，李純厚，徐姍楠，劉永，肖雅元，陳作志. 2015. 基于高通量測序的二長棘鯛微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)與評價[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué)，11（4）：116-120. [Yang B，Lin L，Li C H，Xu S N，Liu Y，Xiao Y Y，Chen Z Z. 2015. Development and evaluation of microsatellite markers in Parargyrops edita[J]. South China Fisheries Science，11（4）：116-120.]

曾曉蕓，楊宗英，田輝伍，汪登強(qiáng). 2015. 基于Mi-Seq高通量測序分析裸體異鰾鰍鮀微衛(wèi)星組成[J]. 淡水漁業(yè)，45（1）：3-7. [Zeng X Y，Yang Z Y，Tian H W，Wang D Q. 2015. Analysis of microsatellite composition in Xenophysogobio nudicorpa using Mi-Seq high throughput sequen-cing[J]. Freshwater Fisheries，45（1）：3-7.]

趙志英，梁麗運(yùn)，白麗蓉. 2018. 斑節(jié)對蝦3個野生群體遺傳多樣性的微衛(wèi)星標(biāo)記分析[J]. 熱帶海洋學(xué)報(bào)，37（3）：65-72. [Zhao Z Y，Liang L Y，Bai L R. 2018. Analysis of genetic diversity among three wild populations of Penaeus mono-don using microsatellite marker[J]. Journal of Tropical Oceanography，37（3）：65-72.]

Benson G. 1999. Tandem repeats finder：A program to analyze DNA sequences[J]. Nucleic Acids Research，27（2）：573-580.

Liu F，Guo Q S，Shi H Z，Cheng B X，Lu Y X，Gou L，Wang J，Shen W B，Yan S M，Wu M J. 2016. Genetic variation in Whitmania pigra，Hirudo nipponica and Poecilobdella manillensis，three endemic and endangered species in China using SSR and TRAP markers[J]. Gene，579（2）：172-182.

Liu F，Shi H Z，Guo Q S，Wang T. 2013. Isolation and characterization of microsatellite loci for the analysis of genetic diversity in Whitmania pigra[J]. Biochemical Systematics and Ecology，51：207-214.

Rousset F. 2008. genepop'007：A complete re-implementation of the genepop software for Windows and Linux[J]. Molecular Ecology Resource，8（1）：103-106.

Simakov O，Marletaz F，Cho S J，Edsinger-Gonzales E，Havlak P，Hellsten U，Kuo D H，Larsson T，Lv J，Arendt D，Savage R，Osoegawa K，de Jong P，Grimwood J，Chapman J A，Shapiro H，Aerts A，Otillar R P，Terry A Y，Boore J L，Grigoriev I V，Lindberg D R，Seaver E C，Weisblat D A，Putnam N H，Rokhsar D S. 2013. Insights into bilaterian evolution from three spiralian genomes[J]. Nature，493（7433）：526-531.

Untergasser A，Cutcutache I，Koressaar T，Ye J，F(xiàn)aircloth B C，Remm M，Rozen S G. 2012. Primer3—New capabilities and interfaces[J]. Nucleic Acids Research，40（15）：e115.

Van Oosterhout C，Hutchinson W F D，Wills D P，Shipley P. 2010. Micro-Checker：Software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data[J]. Molecular Ecology Notes，4（3）：535-538.

Xiong L W，Wang Q，Wang S B，Wang J G，F(xiàn)eng Q，Yue L J. 2017. Description of 21 microsatellites for the Chinese bitterling，Rhodeus sinensis Günther，1868[J]. Journal of Applied Ichthyology，33：940-942.

Zane L，Bargelloni L，Patarnello T. 2002. Strategies for microsatellite isolation：A review[J]. Molecular Ecology，11（1）：1-16.

Zhang X G，Tong J G，Xiong B X. 2006. Applications of microsatellite markers in studies of genetics and breeding of fish[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，3（2）：83-87.