趙奇 鄧培淵 李玉華 楊玉珍 楊宗渠 雷志華

摘要：【目的】研究小菜蛾性信息結(jié)合蛋白（PxylPBP2）與順-9-十四碳烯酸酯（Z9-14∶Ac）結(jié)合的分子動力學(xué)模式、結(jié)合內(nèi)驅(qū)力及關(guān)鍵作用氨基酸，闡明二者識別的分子機(jī)制，為小菜蛾性誘劑的研發(fā)和小菜蛾防治提供參考依據(jù)?！痉椒ā窟\(yùn)用YASARA對PxylPBP2進(jìn)行同源建模，運(yùn)用AutoDock 4.2進(jìn)行PxylPBP2與Z9-14∶Ac的空間結(jié)構(gòu)對接，運(yùn)用YASARA平臺進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，運(yùn)用MMPBSA.py模塊計算PxylPBP2-Z9-14∶Ac復(fù)合物的結(jié)合自由能，以Amber 12軟件包描述結(jié)合關(guān)鍵氨基酸，分析PxylPBP2與Z9-14∶Ac的結(jié)合模式及相互作用力?！窘Y(jié)果】同源建模構(gòu)建了合理的PxylPBP2空間模型，分子對接結(jié)果表明Z9-14∶Ac結(jié)合于PxylPBP2結(jié)合腔的內(nèi)部，受體配體間無氫鍵，1.4 ns時對接復(fù)合物收斂平衡;PxylPBP2-Z9-14∶Ac結(jié)合自由能為-9.76 kcal/mol;Phe22和Ile104的貢獻(xiàn)能量和占總結(jié)合自由能的43%?！窘Y(jié)論】范德瓦斯力和非極性溶劑力是PxylPBP2與Z9-14∶Ac形成穩(wěn)定復(fù)合物的主要內(nèi)驅(qū)力，能量貢獻(xiàn)最大的兩個關(guān)鍵氨基酸（Phe22和Ile104）位于側(cè)鏈上。

關(guān)鍵詞： 小菜蛾;性信息素結(jié)合蛋白（PxylPBP2）;性信息素;分子動力學(xué)模擬;能量分解

中圖分類號： S433.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）11-2193-05

Molecular simulation of interactions between sex pheromone binding proteins and cis-9-tetradecenoic acid ester

in Plutella xylostella

ZHAO Qi1， DENG Pei-yuan2， LI Yu-hua1， YANG Yu-zhen1，YANG Zong-qu1， LEI Zhi-hua1

（1School of Life Science， Zhengzhou Normal University， Zhengzhou? 450044， China; 2Key Laboratory of Biological Species Resource Research of Zhengzhou， Zhengzhou Normal University， Zhengzhou? 450044， China）

Abstract：【Objective】Molecular dynamics model， internal promoting force and key amino acid of sex pheromone binding proteins（PxylPBP2） and cis-9-tetradecenoic acid ester（Z9-14∶Ac） in Plutella xylostella were studied to illustrate the molecular mechanism of their identification and provide reference for research and development of sex attractant for P. xylostella as well as the prevention and control of P. xylostella. 【Method】Some software was used to analyze the binding modes and interactions of PxylPBP2 and z9-14∶Ac， including homology modeling of PxylPBP2 with YASARA， the space structure docking of PxylPBP2 and Z9-14∶Ac with AutoDock 4.2， molecular dynamics simulation with YASARA platform， calculation of binding free energy of PxylPBP2-Z9-14∶Ac complex with MMPBSA. Py module， and description of binding key amino acids as well as analysis of binding mode and interaction force of PxylPBP2 and Z9-14∶Ac with Amber12 package. 【Result】The reasonable PxylPBP2 space model was constructed by homologous modeling. Molecular docking indicated that the binding of Z9-14∶Ac was in the interior of the PxylPBP2 binding chamber and there was no hydrogen bond between receptor ligands. Docking complex was convergent equilibrium at 1.4 ns. The binding free energy of PxylPBP2-Z9-14∶Ac was -9.76 kcal/mol. The contribution energy sum of Phe22 and Ile104 were 43% of the total binding free energy. 【Conclusion】Van der wals force and non-polar solvation are the principal inner drive to form stable complex between PxylPBP2 and Z9-14∶Ac， two key amino acids（Phe22 and Ile104） contribute the most largest amount of energy and they are located on the side chain.

Key words： Plutella xylostella;sex pheromone binding protein（PxylPBP2）;sex pheromone; molecular dynamics simulation; energy decomposition

0 引言

【研究意義】小菜蛾（Plutella xylostella）是危害十字花科蔬菜的重要鱗翅目菜蛾科害蟲。由于長期使用化學(xué)農(nóng)藥防治小菜蛾，導(dǎo)致該害蟲的抗藥性提高（常曉麗等，2017）。采用性信息素進(jìn)行小菜蛾生物防治因具有無害、高效的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采用（陳東旭等，2011）。因此，開展小菜蛾性信息素結(jié)合蛋白與性信息素的分子結(jié)合模式研究，可為新型性誘劑的研發(fā)、修飾和改造等提供重要參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蛾類昆蟲的性信息分子需通過一類小分子量蛋白的攜帶，才能從感器表皮運(yùn)輸?shù)叫嵊X受體神經(jīng)元，這類小蛋白分子被命名為性信息素結(jié)合蛋白（Phe-romone binding proteins，PBPs）（李玉華等，2016）。即對PBPs在昆蟲信息素傳導(dǎo)過程分子機(jī)制的深入研究，可為理解昆蟲信息素傳遞和信息素作用機(jī)理提供直接證據(jù)，同時為研發(fā)信息素類型的高效殺蟲劑提供理論依據(jù)（Mitsuno et al.，2008）。Chisholm等（1983）研究發(fā)現(xiàn)小菜蛾性信息素的主要成分為順-9-十四碳烯酸酯（Z9-14∶Ac）、順-11-十六碳烯酸酯（Z11-16∶Ac）和順-11-十六碳烯醛（Z11-16∶Ald）。孫夢婧（2013）從小菜蛾中鑒定出3個PBPs（PxylPBP1，PxylPBP2和PxylPBP3），熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)證實(shí)PxylPBP2與Z9-14∶Ac特異結(jié)合，同時3種PBPs對性信息素類似物有較強(qiáng)的結(jié)合能力。李玉華等（2016）對PBPs與Z9-14∶Ac進(jìn)行了初步對接研究，但缺少針對性信息素結(jié)合蛋白與性信息素成分相互作用分子機(jī)制的深入研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】與其他大多數(shù)分子對接研究相似，李玉華等（2016）研究了PxylPBP2與性信息素成分Z9-14∶Ac的初步對接，但在受體配體對接過程中受體的構(gòu)象并不是固定不變，而會發(fā)生一些變化，因此本研究在對接基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對PxylPBP2和Z9-14∶Ac進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，以彌補(bǔ)初步對接的不足，且更深入了解PxylPBP2與Z9-14∶Ac相互作用的過程和結(jié)合方式的細(xì)節(jié)。【擬解決的關(guān)鍵問題】以小菜蛾性信息素結(jié)合蛋白PxylPBP2和性信息素成分Z9-14∶AC為研究對象，在分子對接基礎(chǔ)上，采用分子動力學(xué)、結(jié)合自由能計算、能量分解等方法，分析二者間的作用力類型、結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)和自由能，為闡明小菜蛾P(guān)BPs對Z9-14∶Ac的識別機(jī)制提供理論依據(jù)，同時為研發(fā)性信息素類似物、小菜蛾性誘劑及小菜蛾的防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 PxylPBP2三維模型和Z9-14∶Ac分子結(jié)構(gòu)構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載小菜娥PxylPBP2序列，登錄號為AGH13203.1，在蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫（Protein DataBank，PDB）中搜索同源蛋白，將目標(biāo)蛋白序列與模板蛋白序列比對，導(dǎo)入YASARA分子模擬平臺進(jìn)行同源建模，再進(jìn)行去除H2O、加H和添加缺失原子的優(yōu)化處理（Krieger et al.，2002）。

用ChemBioOffice中的ChemBioDraw模塊構(gòu)建Z9-14∶Ac的初始結(jié)構(gòu)，用ChemBio3D進(jìn)行立體空間結(jié)構(gòu)構(gòu)建和最小能量優(yōu)化。

1. 2 分子對接

借助AutoDock 4.2進(jìn)行PxylPBP2與Z9-14∶Ac空間結(jié)構(gòu)對接，使用Autogrid程序進(jìn)行網(wǎng)格計算。分子對接時，將Z9-14∶Ac設(shè)為全柔性結(jié)構(gòu)，并設(shè)分子內(nèi)的旋轉(zhuǎn)鍵任意旋轉(zhuǎn)，由AutoDockTools自動識別。通過局部能量搜索和拉馬克遺傳算法相結(jié)合的方法搜索對接構(gòu)象，100次對接計算后，對結(jié)果進(jìn)行聚類分析，借助Amber評分函數(shù)的打分保留對接能量最低的10個構(gòu)象，選取最小結(jié)合自由能對應(yīng)的構(gòu)象進(jìn)行分析。使用均方根偏差（RMSD）判斷分子對接結(jié)果的可靠性和對接復(fù)合物的穩(wěn)定性（劉吉元，2014）。

1. 3 分子動力學(xué)

借助YASARA分子模擬平臺進(jìn)行PxylPBP2-Z9-14∶Ac復(fù)合物的能量最小化和分子動力學(xué)模擬（Molecular Dynamics，MD）。首先，將PxylPBP2-Z9-14∶Ac溶解于立方體TIP3P顯性H2O模型中，設(shè)為周期性邊界條件，并設(shè)邊界與溶質(zhì)原子間的距離為7.00 ?，使用Amber12力場，通過添加抗衡離子（Na+和Cl-）保持體系電中性。設(shè)MD的模擬條件為：pH 7.4、300 K、NVT正則系宗，體系溫度通過郎格萬方法控制。動態(tài)模擬時長為20.0 ns，采用2.5 fs的積分步長，100 ps的采樣間隔。

分子動力學(xué)模擬過程中的均方根漲落（RMSF）體現(xiàn)了分子對接復(fù)合物的柔性及其結(jié)構(gòu)的局部運(yùn)動特征，結(jié)合過程中柔性越強(qiáng)表明氨基酸數(shù)RMSF值越大（劉明，2010）。

1. 4 結(jié)合自由能計算

運(yùn)用Amber12中的MMPBSA.py模塊，采用分子力學(xué)泊松—玻爾茲曼表面積法（MM-PBSA）（Kollman et al.，2000）計算小菜蛾P(guān)xylPBP2-Z9-14∶Ac復(fù)合物的結(jié)合自由能，選取采樣時間最后10.0 ns的100個構(gòu)象進(jìn)行分析。結(jié)合自由能公式如下：

ΔGbind=ΔGcomplex-ΔGreceptor-ΔGligand? （1）

ΔG=ΔEgas+ΔGsolve-TΔS? ? ? ? （2）

ΔEgas=ΔEele+ΔEvdw? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（3）

ΔGsolve=ΔGpb+ΔGnopolar? ? ? ? ? ? ? ? ?（4）

其中，ΔGbind為結(jié)合自由能，ΔGcomplex為復(fù)合物的結(jié)合自由能，ΔGreceptor為受體結(jié)合自由能，ΔGligand為配體結(jié)合自由能，ΔEvdw為范德華力能，ΔEele為靜電作用力能;溶劑化能（ΔGsolve）包括極性溶劑化貢獻(xiàn)能（ΔGpb）和非極性溶劑化貢獻(xiàn)能（ΔGnopolar）;ΔEgas表示氣相內(nèi)能，TΔS表示體系熵變值，本研究的目的是分析PxylPBP2-Z9-14∶Ac復(fù)合物關(guān)鍵氨基酸與能量貢獻(xiàn)間的關(guān)系，故忽略熵變TΔS（Moreira et al.，2007）。

1. 5 能量分解

基于單個氨基酸能量分解的方法，利用Amber12軟件包描述PxylPBP2和Z9-14∶Ac活性口袋關(guān)鍵氨基酸。氨基酸殘基能量貢獻(xiàn)通過公式換算為4個能量項(xiàng)。公式如下：

ΔG=ΔEele+ΔEvdw+ΔGpb+ΔGnopolar

2 結(jié)果與分析

2. 1 同源建模和模型準(zhǔn)備

基于氨基酸序列和結(jié)構(gòu)一致性的同源檢索，找到與PxylPBP2相似性大于30%的3個模板，登錄號分別為4INWA、1DQE和2WCJA，以此3個模板為基礎(chǔ)進(jìn)行同源建模。對生成的候選模板進(jìn)行優(yōu)化和精選，選擇打分-0.054為最優(yōu)模型，YASARA程序同源建模結(jié)果評價發(fā)現(xiàn)PxylPBP2中的氨基酸幾乎均在最合適區(qū)域，說明PxylPBP2分子的三維模型十分合理，保存模型用于下一步的分子對接。對接配體Z9-14∶Ac結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化處理，保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 2 分子對接結(jié)果

PxylPBP2與Z9-14∶Ac設(shè)為剛性對接，用Grid Box包含分子結(jié)構(gòu)，設(shè)126×126×126對接體系格點(diǎn)，采用0.0375 nm的間距，對接復(fù)合物和二者相互作用如圖1所示。由圖1-A可明顯看出Z9-14∶Ac位于PxylPBP 2結(jié)合腔的內(nèi)部;由圖1-C可看出配體與受體間并未形成氫鍵。

2. 3 MD穩(wěn)定性分析結(jié)果

通過軟件分析出PxylPBP2-Z9-14∶Ac原子的RMSD（圖2）和氨基酸殘基RMSF（圖3）。圖2顯示復(fù)合物在1.4 ns趨于收斂平衡，RMSD在2.10 ?左右波動，說明PxylPBP2-Z9-14∶Ac已達(dá)平衡，復(fù)合物具有較好的穩(wěn)定性，表明分子對接結(jié)果可靠。

RMSF數(shù)據(jù)（圖3）表明，復(fù)合物的RMSF平均值為0.134 nm（1.34 ?），其中氨基酸殘基編號22和編號150左右的區(qū)域波動數(shù)值較大，表明該區(qū)域具有較強(qiáng)的柔性。數(shù)據(jù)波動較小的區(qū)域在氨基酸殘基編號80和編號100左右的區(qū)域，具有非柔性特征，為相對保守區(qū)域。

2. 4 結(jié)合自由能分析結(jié)果

采用MM-PBSA計算PxylPBP2-Z9-14∶Ac結(jié)合自由能（Hou et al.，2011）。由表1可知，PxylPBP2-Z9-14∶Ac結(jié)合自由能為-9.76 kcal/mol，ΔG為負(fù)值，說明對接復(fù)合物會自發(fā)形成鍵合，圖2對接復(fù)合物的RMSD變化曲線也顯示復(fù)合物收斂平衡，波動幅度小，表明PxylPBP2-Z9-14∶Ac可形成穩(wěn)定的復(fù)合物;PxylPBP2-Z9-14∶Ac結(jié)合自由能的標(biāo)準(zhǔn)方差SD=0.47（<0.50），表明結(jié)果可靠。范德瓦斯能量項(xiàng)（ΔEvdw=-42.56 kcal/mol）和非極性溶劑能量項(xiàng)（ΔGnopolar=-32.90 kcal/mol）為PxylPBP2-Z9-14∶Ac的結(jié)合提供了主要驅(qū)動力。極性溶劑化能量項(xiàng)為65.27 kcal/mol，非常不利于PxylPBP2-Z9-14∶Ac的結(jié)合，抑制力量高達(dá)ΔGpb=65.27 kcal/mol，靜電作用能（ΔEele=0.42 kcal/mol）有微弱的抑制力量。自由能分項(xiàng)的標(biāo)準(zhǔn)方差均低于0.50，說明PxylPBP2-Z9-14∶Ac結(jié)合自由能的計算值完全可靠。

2. 5 單個氨基酸殘基的能量分解結(jié)果

單個殘基能量分項(xiàng)體現(xiàn)了單個殘基對模擬體系中所有殘基作用的總和，本研究借助Amber12程序分析單個氨基酸的總能量和側(cè)鏈能量，結(jié)果見表2和圖4。氨基酸能量貢獻(xiàn)超過1.00 kcal/mol的有7個氨基酸，分別為Leu18、Phe22、Leu62、Leu71、 Ile104、Met124和Phe128，其中Phe22和Ile104的貢獻(xiàn)能量均超過2.00 kcal/mol，二者能量之和占總結(jié)合自由能的43%。由圖4可看出，側(cè)鏈能量的分布與總能量基本保持一致，表明編號22、104和128氨基酸能量主要分布在側(cè)鏈上，編號18、62、71和124氨基酸能量主要分布在主鏈上，即這些氨基酸的分布區(qū)域與RMSF的分析結(jié)果一致。

3 討論

Sun等（2013）報道小菜蛾性信息素結(jié)合蛋白（PxylPBP2）與Z9-14∶Ac能特異性結(jié)合，與本研究結(jié)論一致，但其采用的熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)只能定性判斷二者的結(jié)合可能性，不能給出二者互相作用的分子機(jī)制。李玉華等（2016）采用分子對接研究了小菜蛾性信息素結(jié)合蛋白、性信息素、受體蛋白三者間相互作用的分子機(jī)制， 其研究重點(diǎn)是比較小菜蛾性信息素受體蛋白和性信息素結(jié)合蛋白對性信息素結(jié)合機(jī)制的差異，因此只是針對Z9-14∶Ac與性信息素受體蛋白和性信息素結(jié)合蛋白間的結(jié)合能力差異進(jìn)行比較，且只進(jìn)行靜態(tài)對接研究和分析，同樣缺少二者相互作用的分子機(jī)制。本研究在對接基礎(chǔ)上從分子動力學(xué)角度更細(xì)致深入地揭示性信息素結(jié)合蛋白PxylPBP2與性信息素Z9-14∶Ac作用的分子機(jī)理，結(jié)果表明二者結(jié)合自由能為 -9.76 kcal/mol，復(fù)合物在1.4 ns時達(dá)2.10 ?的收斂平衡。此外，RMSF數(shù)據(jù)顯示，編號22和編號150左右的區(qū)域柔性較大，且能量貢獻(xiàn)占總能量43%的兩個氨基酸（Phe22和Ilel04）均位于側(cè)鏈上，該結(jié)果合理地給出了小菜蛾性信息結(jié)合蛋白PxylPBP2與性信息素Z9-14∶Ac的作用模式。

本研究結(jié)果表明配體與受體間并未形成氫鍵，而李玉華等（2016）的研究結(jié)果表明二者之間形成了氫鍵，表面上看似研究結(jié)果不一致，但本質(zhì)上兩個結(jié)論并不沖突，究其原因是本研究采用的YASARA軟件模擬力場不同，以及靜態(tài)模擬和動態(tài)模擬的差異所致。能量分解結(jié)果表明，能量值貢獻(xiàn)超過1.00 kcal/mol的Leu數(shù)量有3個，說明Leu在復(fù)合物結(jié)合過程中具有極重要作用，此結(jié)論與李玉華等（2016）研究中Leu產(chǎn)生的疏水作用力有效促進(jìn)復(fù)合物的結(jié)合結(jié)論一致。但本研究未對關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行丙氨酸突變掃描，無法進(jìn)一步確定“熱點(diǎn)”氨基酸、“暖點(diǎn)”氨基酸和“非點(diǎn)”氨基酸，以及確定關(guān)鍵氨基酸的能量貢獻(xiàn)是來自于蛋白質(zhì)內(nèi)部其他氨基酸的作用能還是來自于外部分子的作用，均有待進(jìn)一步探究。

本研究結(jié)果為進(jìn)一步了解小菜蛾性信息素結(jié)合蛋白與性信息素的分子作用機(jī)制提供參考，值得一提的是，PxylPBP2與關(guān)鍵殘基的相互作用可初步指導(dǎo)新型性誘劑的研發(fā)，能量分解發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生不利于結(jié)合的負(fù)效應(yīng)氨基酸等信息可用于性誘劑的修飾改造，有望在此基礎(chǔ)上開發(fā)出新型的無害性誘劑。

4 結(jié)論

PxylPBP2與Z9-14∶Ac能形成穩(wěn)定的對接復(fù)合物，范德瓦斯力和非極性溶劑力為主要內(nèi)驅(qū)力，極性溶劑化能是妨礙結(jié)合的主要抑制力量， 關(guān)鍵氨基酸為Leu18、Phe22、Leu62、Leu71、Ile104、Met124和Phe128，能量貢獻(xiàn)最大的兩個關(guān)鍵氨基酸（Phe22和Ile104）位于側(cè)鏈上。

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