李媛媛 劉亞坤 李忠堯 韓瑋欣 何俊瑛 卜暉

腦膜癌病 （leptomeningeal carcinomatosis,LC）是原發(fā)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，局灶或彌漫浸潤(rùn)軟腦膜及蛛網(wǎng)膜下腔，并播散至腦脊液[1-2]，是惡性腫瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的一種較少見(jiàn)類(lèi)型，原發(fā)腫瘤常為肺癌[3]，腺癌是常見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型[4]。國(guó)外學(xué)者較早通過(guò)小腦延髓池（cisterna magna,CM）穿刺進(jìn)行腦膜癌病大鼠模型的實(shí)驗(yàn)性研究及鞘內(nèi)給藥方式需要較復(fù)雜的操作過(guò)程[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)腦膜癌病動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行改進(jìn)，旨在建立操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性較好的腦膜癌病小鼠模型，為進(jìn)一步探討腦膜癌病發(fā)病機(jī)制及評(píng)估相關(guān)治療藥物的有效性及安全性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 清潔級(jí)C57BL/6小鼠，雌性，6～8周，體質(zhì)量17～21 g。實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。雌性C57BL/6小鼠35只，其中20只隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只，分別經(jīng)小腦延髓池注射PBS或Lewis肺癌細(xì)胞懸液，觀察評(píng)估注射后兩組小鼠行為學(xué)表現(xiàn)；15只隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=3）、PBS 組（n=6）和模型組（n=6），當(dāng)小鼠癥狀表現(xiàn)明顯時(shí)，切片進(jìn)行軟腦（脊）膜病理HE染色。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及培養(yǎng) 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株（Lewis lung carcinoma cell line,LLC）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)。LLC用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 （添加青霉素100 U/mL，鏈霉素100μg/mL）置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3 小鼠小腦延髓池注射法 首先腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉小鼠。小鼠取俯臥位，在其頸部下面墊一個(gè)10 mL注射器針筒，使小鼠頭部和軀干形成約120°角度（圖1 A）。剪掉小鼠頸背部毛，75%酒精局部消毒，在兩耳后部連線處做一皮膚中線切口，清晰暴露頸背部中線（圖1 B）。左手拇指、食指輕柔固定小鼠頭部，右手持25μL尖頭微量進(jìn)樣器，針尖傾斜約45°，沿頸背部中線從枕外隆凸與第一頸椎之間的間隙穿刺，有較明顯落空感表明針尖已進(jìn)入小腦延髓池，進(jìn)針深度約 4 mm（圖 1 C），然后緩慢（3 μL/min）注射備好的 LLC 細(xì)胞（圖 1 D）懸液（2×107mL-1，實(shí)驗(yàn)組）或無(wú)菌PBS（對(duì)照組）7.5μL。注射完畢后，針頭在原位留置約30 s，之后拔出針頭，消毒，將小鼠放回籠內(nèi)。模型制備前期，可先將小鼠麻醉，經(jīng)小腦延髓池緩慢注射10μL稀釋的墨汁溶液，之后解剖小鼠腦及脊髓，可見(jiàn)墨汁溶液主要分布于小腦延髓池、腹側(cè)腦池（圖2），提示穿刺注射成功。模型制備過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)組死亡2只，對(duì)照組死亡1只，均按實(shí)驗(yàn)分組依次補(bǔ)齊，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

圖1 小鼠小腦延髓池注射方法示意圖。 A-C：小鼠小腦延髓池注射過(guò)程示意圖；D：顯微鏡下 LLC細(xì)胞形態(tài)（40×10，比例尺50 μm）

1.4 小鼠體質(zhì)量的測(cè)量 小鼠行小腦延髓池注射當(dāng)天記為day 0，以后每24 h，即每天早8:00～9:00稱取小鼠體質(zhì)量，并記錄實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠體質(zhì)量隨時(shí)間變化情況。

1.5 小鼠神經(jīng)系統(tǒng)癥狀表現(xiàn)的評(píng)估 小鼠體質(zhì)量下降超過(guò)10%，并且出現(xiàn)以下表現(xiàn)之一可認(rèn)為是出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀表現(xiàn)：①小鼠活動(dòng)明顯減少，全身狀態(tài)差；②小鼠出現(xiàn)弓背姿勢(shì)；③小鼠步態(tài)不穩(wěn)，行走緩慢；④將小鼠尾巴拎起，小鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。

圖2 墨汁溶液經(jīng)小腦延髓池注射后分布于小鼠蛛網(wǎng)膜下腔。A：可見(jiàn)墨汁溶液分布于小腦延髓池部位（箭頭所示）；B：墨汁溶液分布于腹側(cè)腦池

1.6 石蠟切片HE染色 小腦延髓池注射LLC細(xì)胞后，觀察至實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)癥狀表現(xiàn)如消瘦、明顯虛弱、全身狀態(tài)差且癥狀進(jìn)行性加重時(shí)，4%多聚甲醛灌注固定，待小鼠尾巴及四肢僵硬后，取腦及脊髓組織，同時(shí)取材對(duì)照組。固定后的標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、浸蠟及包埋后，制成蠟塊。Leica RM2235石蠟切片機(jī)切片，厚度為5μm，切片經(jīng)脫蠟后進(jìn)行常規(guī)HE染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果數(shù)據(jù)服從正態(tài)性及方差齊性者，計(jì)量資料的統(tǒng)計(jì)描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性或方差齊性者，計(jì)量資料的統(tǒng)計(jì)描述采用M（QL，QU）表示，兩組間均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗(yàn)。兩組生存曲線差異的比較采用log-rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重變化情況及生存期 小腦延髓池注射前對(duì)照組小鼠體質(zhì)量為（18.68±1.08）g，實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量為（19.43±0.86）g，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.729，P=0.101）。小腦延髓池注射后第1天，兩組小鼠體重均下降明顯，對(duì)照組小鼠體質(zhì)量為 （17.02±1.63）g，實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量為（17.08±1.06）g，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=0.101,P=0.921）。第2～3天，兩組小鼠體質(zhì)量水平仍較低， 分別為 （17.02±1.67）g，（16.59±1.09）g；（17.21±1.49）g，（16.93±1.08）g；t依次為-0.692，-0.409，均 P＞0.05），較前變化不大。第 4～10 天，兩組小鼠體質(zhì)量均緩慢回升，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t/Z 值依次為-0.081，-0.594，-0.302，-0.676，-1.058，-1.086，-1.589，均 P＞0.05）。第 11～37 天，對(duì)照組小鼠體質(zhì)量仍在逐漸增長(zhǎng)，而實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量開(kāi)始進(jìn)行性下降直至死亡，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t依次為-2.378，-4.794，-3.78，-8.283，-8.462，-9.798，-8.258，-6.981，均 P＜0.05）。 見(jiàn)表1、圖3 A。實(shí)驗(yàn)組小鼠均在40 d內(nèi)死亡，中位生存時(shí)間為32.5 d，而對(duì)照組小鼠均至觀察終點(diǎn)40 d仍存活，log-rank 檢驗(yàn)（χ2=21.03，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3 B）。

2.2 小鼠神經(jīng)系統(tǒng)癥狀表現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)組小鼠小腦延髓池注射LLC細(xì)胞后癥狀出現(xiàn)在第10～16天，平均為(13±2)d。全部實(shí)驗(yàn)組小鼠表現(xiàn)為活動(dòng)明顯減少，全身狀態(tài)差；其中6只小鼠病程中出現(xiàn)了弓背姿勢(shì)；5只小鼠出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)；2只小鼠出現(xiàn)拎起尾巴旋轉(zhuǎn)的表現(xiàn)。而對(duì)照組小鼠均活動(dòng)正常，未出現(xiàn)上述異常表現(xiàn)。

表1 兩組小鼠體質(zhì)量（g）變化

圖3 小腦延髓池注射LLC細(xì)胞懸液或PBS后兩組小鼠體質(zhì)量變化情況及生存曲線。A：注射后第11天，與PBS對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量開(kāi)始明顯下降，*P＜0.05；B：兩組小鼠生存曲線比較

2.3 組織病理學(xué)HE染色分析模型小鼠腫瘤浸潤(rùn)腦膜情況 小腦延髓池注射LLC細(xì)胞后，模型組小鼠癥狀表現(xiàn)明顯時(shí)（即出現(xiàn)明顯消瘦、虛弱、全身狀態(tài)差或出現(xiàn)弓背姿勢(shì)等表現(xiàn)時(shí)），腦及脊髓組織病理HE染色結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)軟腦膜，以腦基底部及脊髓頸段多見(jiàn)。正常對(duì)照組及PBS組小鼠軟腦膜未見(jiàn)明顯異常。見(jiàn)圖4。

3 討論

目前腦膜癌病的治療效果不理想，為進(jìn)一步探索相關(guān)治療靶點(diǎn)，以及評(píng)估相關(guān)治療藥物及方法的有效性及安全性，首先需要建立穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。LLC細(xì)胞是小鼠來(lái)源的肺腺癌細(xì)胞，來(lái)源于C57BL荷瘤小鼠，廣泛應(yīng)用于小鼠移植瘤模型中，有文獻(xiàn)報(bào)道LLC細(xì)胞能夠在腦脊液中生長(zhǎng)[6]。 因此，本實(shí)驗(yàn)采用LLC細(xì)胞株及C57BL/6小鼠進(jìn)行疾病模型的實(shí)驗(yàn)建立。

REIJNEVELD等[7]描述了一種重復(fù)性較好的、經(jīng)小腦延髓池穿刺而建立的黑色素瘤腦膜癌小鼠模型，可進(jìn)行重復(fù)鞘內(nèi)給藥干預(yù)，適于評(píng)估一些新治療方案（包括基因治療）的有效性及毒性作用。但需要實(shí)驗(yàn)者準(zhǔn)確觸摸并定位穿刺點(diǎn)。CHEN等[8]研究中，小鼠小腦延髓池注射時(shí)通過(guò)做頸背部中線皮膚切口，準(zhǔn)確暴露穿刺點(diǎn)，從而一定程度上避免了穿刺的盲目性。本實(shí)驗(yàn)中，綜合上述實(shí)驗(yàn)方法并加以改進(jìn)，主要是在小鼠頸部下面墊一個(gè)10 mL注射器針筒，使小鼠頭部和軀干形成約120°角度，便于傾斜進(jìn)針；并做一皮膚中線切口，暴露頸背部中線，沿頸背部中線尋至顱骨枕外隆凸，貼著枕骨骨面傾斜進(jìn)針，即與第一頸椎間隙進(jìn)針，穿刺點(diǎn)清晰可辨；有較明顯落空感表明針已進(jìn)入小腦延髓池，距針尖約4 mm處設(shè)置一小橡膠塞，防止進(jìn)針過(guò)深傷及小鼠腦干，造成實(shí)驗(yàn)小鼠死亡；注射完畢后針頭原位留針約30 s，減少注射液滲出。

圖4 不同處理組小鼠腦和脊髓組織HE染色。 A-B：分別為正常對(duì)照組、PBS組小鼠腦組織，軟腦膜未見(jiàn)異常；C-D：模型組小鼠中腦背側(cè)腦膜可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)（HE×40，HE×200）；E-F：模型組小鼠延髓背側(cè)腦膜可見(jiàn)彌漫腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn) （HE×40，HE×200）；G-H：模型組小鼠頸髓軟脊膜可見(jiàn)局灶腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)（HE×40，HE×200）（C、E、G 比例尺 200 μm，A、B、D、F、H 比例尺 50 μm）

腦膜癌病常發(fā)生于惡性腫瘤晚期階段，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至腦脊液，并可迅速播散到整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，浸潤(rùn)腦、脊髓、顱神經(jīng)和/或脊神經(jīng)，引起嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙甚至死亡[3,9]。文獻(xiàn)報(bào)道腦膜癌病模型大鼠或小鼠癥狀常表現(xiàn)為體重下降[7,10]，明顯虛弱，全身狀態(tài)差[5,7,10]，步態(tài)不穩(wěn)[5]，肢體癱瘓[5]，弓背姿勢(shì)[10]，拎起尾巴時(shí)小鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)[10]等。本實(shí)驗(yàn)采用LLC細(xì)胞經(jīng)小腦延髓池穿刺注射C57BL/6小鼠而建立疾病模型。注射后第1～10天，兩組小鼠體質(zhì)量均先下降后逐漸回升，考慮麻醉、手術(shù)操作等有創(chuàng)損傷后小鼠體質(zhì)量下降，隨后處于恢復(fù)期小鼠體質(zhì)量回升。至第11天，對(duì)照組小鼠體質(zhì)量仍在逐漸增長(zhǎng)，而實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量開(kāi)始進(jìn)行性下降直至死亡，考慮可能與疾病進(jìn)展、腫瘤消耗等相關(guān)。實(shí)驗(yàn)組小鼠癥狀出現(xiàn)時(shí)間平均為（13±2）d，主要表現(xiàn)為活動(dòng)明顯減少，全身狀態(tài)差，部分小鼠病程中出現(xiàn)了弓背姿勢(shì)、步態(tài)不穩(wěn)及拎起尾巴旋轉(zhuǎn)的表現(xiàn)，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

組織病理學(xué)研究表明，腦膜癌病患者腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)蛛網(wǎng)膜下腔，病灶多見(jiàn)于腦基底部及脊髓下段，馬尾部位較常見(jiàn)[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，模型鼠腦膜及脊膜的病理改變與腦膜癌病患者類(lèi)似，顯微鏡下多可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)腦基底部及馬尾，可能與腫瘤細(xì)胞隨腦脊液循環(huán)而易于粘附、沉積此處相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈竽X及脊髓組織切片HE染色結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞彌漫或局灶浸潤(rùn)軟腦膜、蛛網(wǎng)膜下腔，以腦基底部及脊髓頸段為主，可能由于這些部位接近注射部位，亦或腫瘤細(xì)胞易于粘附、沉積?？紤]可通過(guò)增加注射細(xì)胞懸液體積至10μL（文獻(xiàn)報(bào)道小鼠可耐受），細(xì)胞數(shù)不變，從而一定程度稀釋所注射的細(xì)胞懸液，使得腫瘤細(xì)胞更易隨腦脊液循環(huán)而播散；或通過(guò)注射后改變小鼠體位，如人為將小鼠立起一定時(shí)間，使得所注射細(xì)胞懸液更易于隨腦脊液循環(huán)。此外，本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠癥狀表現(xiàn)明顯時(shí)取材，該病理表現(xiàn)亦可能與取材時(shí)間相關(guān)，應(yīng)進(jìn)一步于接種腫瘤細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)分別取材研究其病理改變的動(dòng)態(tài)變化，從而更好了解模型小鼠疾病的病理變化。