高月 ，李子江 ,2，吳磊 ，司傳領(lǐng) *

（1.天津科技大學(xué)，天津市制漿造紙重點實驗室，天津300457；2.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東濟(jì)南250103；3.江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌330096）

香樟（Cinnamomum camphoraPresl.）系樟科樟屬常綠喬木，別名樟樹、樟木、芳樟、烏樟、油樟等[1-3]，主要分布在熱帶及亞熱帶地區(qū)，在我國主要分布于長江流域以南，以海南、福建、江西、臺灣、湖北等省為主。香樟提取物中富含木脂素、萜類、黃酮類及生物堿類，具有抑菌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生物活性作用，已成為香料、醫(yī)藥、化工產(chǎn)品的重要原料來源[4-9]。目前關(guān)于香樟枝抗氧化活性的研究還十分有限，本研究通過常溫浸提、分級萃取得到6種不同極性提取物，采用DPPH法[10]和還原能力法[11]兩種體外抗氧化活性試驗對其抗氧化性能進(jìn)行評價，旨在為香樟枝抗氧化劑的合成及開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香樟枝采集于江西省科學(xué)院院內(nèi)，于陰涼處自然風(fēng)干，將其干燥至水分≤8%后進(jìn)行粉碎、過篩，備用。

DPPH購自美國Sigma公司，無水甲醇、無水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、濃硫酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、氯化鐵，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能粉碎機(jī)，F(xiàn)C-110上海中藥機(jī)械廠；電子分析天平，CAV4101III，奧豪國際貿(mào)易有限公司；超聲波清洗器，SK06GT，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；紫外分光光度計，UV-2500，日本；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-52A，上海亞榮生化設(shè)備儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，GG-101BS，天津市天宇儀器實驗有限公司；冷凍干燥機(jī)，F(xiàn)D-5A-120，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 香樟枝不同極性提取物的制備

稱取香樟枝粗粉4.17kg，室溫下用90%的乙醇浸提72h，過濾、濃縮后，用懸蒸液（<95%的乙醇）同法再提取兩次，合并3次的濃縮液，冷凍干燥得香樟枝醇提物。將部分醇提物分散于水中，用不同極性溶劑進(jìn)行萃取，依次得到石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物以及萃取剩余物（水相）。香樟枝醇提物及各萃取物的提取分離流程如圖1所示。

圖1 香樟枝不同極性提取物萃取、分離過程Fig.1 Extraction and fractionation procedures of different polarextracts fromCinnamomum camphorabranches

1.3.2 香樟枝不同極性提取物溶液的配制

稱取香樟樹枝醇提物、各萃取相粉末，分別用無水乙醇溶解并稀釋到所需濃度。

1.3.3 清除DPPH自由基能力評價

吸取上述不同梯度濃度的待測樣品溶液2mL于10mL刻度試管中，依次迅速加入0.06mg/mL DPPH溶液2mL，避光搖勻靜置。去離子水代替樣品溶液作空白樣。室溫下避光反應(yīng)30min后，于517nm波長處測其吸光度值，通過加入自由基清除劑及抗氧化劑吸光度的變化來計算DPPH自由基的清除率，測定2次，并按照上述操作步驟進(jìn)行3次平行試驗。

式中：SADPPH為清除率；A0為以蒸餾水代替樣品的空白吸光度；A1為加樣反應(yīng)后反應(yīng)液的吸光度。

1.3.4 還原能力評價

吸取上述不同濃度梯度的待測樣品溶液2.5mL，分別加入2.5mL的磷酸緩沖液（pH6.6）和1%K3[Fe(CN)6]溶液，振搖使其混合均勻。置于50℃恒溫水浴中加熱20min，冰水浴迅速冷卻后，依次加入三氯乙酸溶液2.5mL，搖勻后于3000r/min條件下離心10min。移取上清液1.0mL，加入0.5mL的0.1%FeCl3溶液和7.0mL去離子水搖勻。用紫外分光光度計法在700nm波長處測出其吸光度值，去離子水代替樣品溶液作空白樣。測定2次，并按照上述操作步驟進(jìn)行3次平行試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟枝不同極性提取物的制備得率

香樟枝醇提物、石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水相得率如表1所示。

表1 香樟枝不同極性萃取物得率Table 1 Yields of polar different fromcinnamomum camphorabranches

由表1可以看出，香樟枝不同極性提取物得率由大到小依次為醇提物（4.57%）、石油醚萃取物（1.17%）、正丁醇萃取物（1.07%）、乙酸乙酯萃取物（0.79%）、萃取剩余物（0.70%）和二氯甲烷萃取物（0.37%）。香樟枝醇提物經(jīng)不同極性溶劑萃取后得到石油醚萃取物的含量最高為48.61g，二氯甲烷萃取物的含量最低為15.32g。

2.2 DPPH自由基清除試驗

根據(jù)自由基清除能力計算公式可得清除率與樣品濃度的線性關(guān)系。

醇提物濃度（μg/mL）與清除率（%）的線性方程為y=0.0048x+0.0138，R2=0.9968；

石油醚萃取物濃度（μg/mL）與清除率的線性方程為y=0.0011x-0.0153，R2=0.9991；

二氯甲烷萃取物濃度（μg/mL）與清除率的線性方程為 y=0.0019x+0.0549，R2=0.9990；

乙酸乙酯萃取物濃度（μg/mL）與清除率的線性方程為 y=0.0155x+0.0226，R2=0.9923；

正丁醇萃取物濃度（μg/mL）與清除率的線性方程為y=0.0158x+0.0321，R2=0.9949；

水相濃度（mg/mL）與清除率的線性方程為y=0.1496x+0.0485，R2=0.9924。

可見，乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物對DPPH自由基的清除效果較好，水相對DPPH自由基的清除效果較弱。

圖2 不同濃度的有機(jī)萃取相對DPPH自由基的清除活性Fig.2 DPPH scavenging activity of different concentration samples

表2 香樟枝各有機(jī)溶劑萃取物清除DPPH自由基的IC50值Table 2 DPPH free radical scavenging activity(IC50)of different soluble fractions fromCinnamomum camphora branches

試驗選用二丁基羥基甲苯（BHT）做陽性對照[12]，其中香樟枝不同極性提取物清除DPPH自由基的IC50值如表2所示，IC50值越小，表明實驗樣品對DPPH自由基的清除效果越顯著，抗氧化活性越強(qiáng)；反之抗氧化活性較弱。觀察表3可以得出結(jié)論：與陽性對照相比，香樟枝不同極性萃取物對DPPH自由基均有一定的清除作用，抗氧化活性成分主要存在于中等極性部分。比較醇提物及各萃取物的IC50值，得出香樟枝乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的抗氧化活性明顯優(yōu)于其它萃取物。

2.3 還原能力的評價試驗

圖2顯示了香樟枝不同極性萃取物還原能力的評價結(jié)果，由圖可以看出，香樟枝不同極性萃取物在一定濃度范圍內(nèi)均具有還原能力，其大小順序依次為乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、醇提物、二氯甲烷萃取物、石油醚萃取物和水相。同一濃度下的還原能力不同，但一定濃度范圍內(nèi)還原能力的變化趨勢具有一致性，隨著樣品溶液的濃度增大，還原能力增強(qiáng)，即抗氧化活性增強(qiáng)。其中乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的還原能力在各個濃度下均較強(qiáng)，表明香樟枝乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物中含有大量的還原性物質(zhì)，即抗氧化活性成分。

圖3 香樟枝不同極性提取物還原能力Fig.3 Reducing power of different polar extracts from Cinnamomum camphorabranches

3 結(jié)論

兩種體外抗氧化試驗方法結(jié)論幾乎一致，香樟枝不同極性提取物中均具有一定的抗氧化活性。在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的提高，抗氧化能力逐漸增強(qiáng)。不同極性提取物的抗氧化活性具有明顯的差異性，中等極性乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，清除DPPH自由基和還原Fe3+能力也較強(qiáng)；醇提物和二氯甲烷萃取物的抗氧化能力居中；石油醚萃取物和水相抗氧化活性相對較弱。因此，開發(fā)香樟枝抗氧化劑方面的應(yīng)用具有較為現(xiàn)實的意義，此外可以進(jìn)一步分離鑒定香樟枝中具有較強(qiáng)抗氧化生物活性的單體成分，為香樟枝抗氧化劑的開發(fā)、改性、合成及應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。