徐紹輝 張志鵬 黃勝堂 沈園園 于坤宏

摘 要 目的：制備鍵合紫杉醇（PTX）和姜黃素（CUR）的金納米棒（GNR）（PTX/CUR-BPGNR），并初步研究其體外抗腫瘤多藥耐藥（MDR）作用及機(jī)制。方法：用晶種生長(zhǎng)法制備GNR，然后經(jīng)生物素-聚乙二醇修飾制成GNR（BPGNR）。分別合成PTX和CUR的硫辛酸酯（PTXLA和CURLA），使用核磁共振氫譜（1H-NMR）和質(zhì)譜等手段確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。利用金硫鍵牢固的結(jié)合作用，將PTXLA和CURLA連接到BPGNR表面，得到鍵合PTX和CUR的BPGNR（PTX/CUR-BPGNR）。觀察其形貌，考察其載藥量和體外釋藥情況（近紅外光照和酯酶條件下）。以阿霉素（ADR）的MDR人乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR為研究對(duì)象，分別經(jīng)PTX、CUR、PTX/CUR混合物和PTX/CUR-BPGNR處理后，采用MTT法考察MCF-7/ADR細(xì)胞的存活率，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞中P-糖蛋白（P-gp）表達(dá)水平。結(jié)果：成功制得PTX/CUR-BPGNR，其大小、形狀均一，最大吸收波長(zhǎng)為808 nm，其中PTX和CUR的載藥量分別為16.1%、8.4%，同時(shí)給予近紅外光照和酯酶能促進(jìn)PTX和CUR釋放，64 h的累積釋放度分別可達(dá)37.2%、39.1%。BPGNR、PTX、CUR、PTX/CUR混合物和PTX/CUR-BPGNR處理后MCF-7/ADR細(xì)胞的存活率分別為95.8%、71.2%、91.9%、45.8%、22.5%，細(xì)胞中P-gp的相對(duì)表達(dá)水平分別為105.6%、75.2%、73.8%、51.7%。結(jié)論：成功制得PTX/CUR-BPGNR，其可提高CUR抑制P-gp表達(dá)的能力，從而增強(qiáng)藥物抗MDR的作用。

關(guān)鍵詞 紫杉醇；姜黃素；金納米棒；抗腫瘤多藥耐藥；P-糖蛋白

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare paclitaxel（PTX） and curcumin （CUR） chemically conjugated gold nanorod （GNR） （PTX/CUR-BPGNR）， and to preliminarily study its anti-multidrug-resistant（MDR） tumor effect in vitro and mechanisms. METHODS： GNR was prepared by seed growth method and modified with biotin-polyethylene glycol （Biotin-PEG） to obtain BPGNRs. Lipoic acid PTX and CUR （PIXLA and CURLA） were synthesized； 1H-NMR and MS were used to confirm their chemical structures. PTXLA and CURLA were connected to BPGNR surface to obtain PIX and CUR-bonding BPGNR （PTX/CUR-BPGNR） via strong binding of Au-S bond. The morphology of PTX/CUR-BPGNR was observed， and drug-loading amount and in vitro drug release were investigated （under near-infrared illumination and esterase condition）. Adriamycin （ADR） MDR breast cancer MCF-7/ADR cells were selected as research objects， and MTT assay was used to investigate the survival rate of cells after treated with BPGNR， PTX， CUR， PTX/CUR mixture and PTX/CUR-BPGNR， and ELISA was used to detect the expression of P-gp. RESULTS： PTX/CUR-BPGNR was prepared successfully with uniform size and shape. The maximum absorption wavelength was 808 nm， and drug-loading amount of PTX and CUR were 16.1% and 8.4%， respectively. The preparations were given near-infrared illumination and esterase to promote the release of PTX and CUR. 64 h accumulative drug release rates were 37.2% and 39.1%. Survival rates of MCF-7/ADR cells after treated with BPGNR， PTX， CUR and PTX/CUR mixture， PTX/CUR-BPGNR were 95.8%， 71.2%， 91.9%， 45.8% and 22.5%， respectively. The relative expressions of P-gp in cells were 105.6%， 75.2%， 73.8%， 51.7%， respectively. CONCLUSIONS： PTX/CUR-BPGNR is successfully prepared and can improve the ability of CUR inhibiting the expression of P-gp so as to strengthen its anti-MDR effects.

KEYWORDS Paclitaxel； Curcumin； Gold nanorods； Multidrug resistant cancer； P-gp

多藥耐藥（MDR）是臨床上腫瘤化療失敗的主要原因，其產(chǎn)生機(jī)制較為復(fù)雜，但最常見(jiàn)的原因是腫瘤細(xì)胞表面藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體如P-糖蛋白（P-gp）過(guò)表達(dá)，使細(xì)胞向外排出抗腫瘤藥物，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度維持在較低水平，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐受性增強(qiáng)[1]。針對(duì)這一原因，目前抗MDR研究主要有兩種策略[2-3]：（1）使藥物避開(kāi)藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的識(shí)別，改變藥物進(jìn)入細(xì)胞的方式；（2）抑制藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)或功能。

聯(lián)合化療是臨床廣泛使用的治療腫瘤的方法，具有減小抗腫瘤藥物劑量、減輕耐藥風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)[4]。眾多研究[2-3]報(bào)道，抗腫瘤藥物與藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑（如P-gp抑制劑）聯(lián)用，可以顯著逆轉(zhuǎn)腫瘤的MDR。紫杉醇（PTX）是臨床上廣泛用于治療乳腺癌、卵巢癌的抗腫瘤藥物，其主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞有絲分裂，從而阻止癌細(xì)胞分裂增殖。有研究表明，PTX是P-gp的作用底物，P-gp過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞（如MDR細(xì)胞MCF-7/DOX）可以減少PTX在細(xì)胞內(nèi)的蓄積[5-6]。姜黃素（CUR）是一種具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性的天然產(chǎn)物，其能抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）等通路從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。近年來(lái)許多研究表明，CUR是一種優(yōu)良的P-gp抑制劑，能夠逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的腫瘤MDR[7-8]。鑒于PTX和CUR不同的抗腫瘤機(jī)制及CUR的P-gp抑制功能，因此PTX和CUR聯(lián)用后，不僅有助于減輕PTX帶來(lái)的毒副作用，也可以在一定程度上克服腫瘤的MDR[9-10，15]。

金納米棒（GNR）具有良好的生物相容性和較大的比表面積，是一種優(yōu)良的藥物載體。藥物分子、基因等生物大分子能通過(guò)靜電吸附或化學(xué)鍵合等方式連接到其表面，從而實(shí)現(xiàn)靶向藥物輸送。GNR還具有高效的光熱轉(zhuǎn)換效率，能吸收近紅外（NIR）光照并將其轉(zhuǎn)換成熱量，被廣泛用于腫瘤光熱治療[11]。

本研究將PTX和CUR分別與硫辛酸（LA）反應(yīng)合成其對(duì)應(yīng)的硫辛酸酯（PTXLA和CURLA），然后利用金硫鍵牢固的結(jié)合作用，將PTXLA和CURLA連接到經(jīng)生物素-聚乙二醇（Biotin-PEG）修飾的GNR（BPGNR）表面制成鍵合PTX和CUR的BPGNR（PTX/CUR-BPGNR），并初步研究其體外抗腫瘤MDR作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

JEM-2100F 透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；U2910紫外-可見(jiàn)光-NIR分光光度計(jì)（日本日立公司）；LENS-808CC-A5光纖激光連接器（深圳理歐光電科技有限公司）；Varioskan Flash酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo公司）；Mercury Plus-400M核磁共振波譜儀（美國(guó)Varian公司）；HC-2066高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；Nano-ZS/ZEN-3600納米粒度和Zeta電位儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；1260高效液相色譜（HPLC）儀和ZORBAX色譜柱（美國(guó)安捷倫科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

PTX原料藥（云南紫云生物分析公司，批號(hào)：Z160115，純度：99%）；CUR原料藥（上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司，批號(hào)：FN19，純度：99%）；PTX、CUR標(biāo)準(zhǔn)品（上海廣銳生物科技有限公司，批號(hào)：162-171127、007-150413，純度：均>98%）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，純度：99%）、硝酸銀（純度：>99.99%）、豬肝酯酶（PLE）（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：BCBS5500V、MKBX7704V、SLBK3815V）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽、胰酶、胎牛血清（FBS）（上海索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：303H0510、20150623、140716）；Biotin- PEG-LA（上海芃碩生物科技有限公司，批號(hào)：C02233）；硼氫化鈉、氯金酸、抗壞血酸、3-羥基-7-溴-2-萘甲酸（7-BrHNA，純度：99%）、二氯甲烷（DCM）、LA、四氫呋喃（THF）、三氟乙酸（TFA）、正己烷、聚山梨酯80、石油醚、乙酸乙酯、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC· HCl）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純）；人P-gp酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：201612）。

1.3 細(xì)胞

耐阿霉素和PTX的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR由上海藥物研究所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 BPGNR的制備

按照文獻(xiàn)提供的晶種生長(zhǎng)法制備GNR[12]。首先制備金種子溶液，將5 mL 0.2 mol/L CTAB溶液和5 mL 0.5 mmol/L 氯金酸溶液混合，隨后加入0.6 mL 冰浴后的0.01 mmol/L 硼氫化鈉溶液，上述溶液劇烈攪拌2 min后，接著在30 ℃水浴中靜置2 h備用。然后制備生長(zhǎng)液，取1.080 g CTAB、0.061 2 g 7-BrHNA溶于30 mL 30 ℃水中，加入0.96 mL 4 mmol/L 硝酸銀，靜置15 min后，加入30 mL 1 mmol/L氯金酸溶液、0.1 mL 37%濃鹽酸，400 r/min攪拌15 min。隨后向其中加入0.3 mL 0.1 mol/L 抗壞血酸溶液，劇烈攪拌1 min后，加入96 μL制備好的金種子溶液，劇烈攪拌30 s后，在30 ℃水浴中靜置生長(zhǎng)12 h，生長(zhǎng)后的GNR溶液，以6 800×g離心30 min，用去離子水洗滌3次，將所得沉淀保存于去離子水中，即得CTAB表面包覆的GNR（CTAB-GNR）。

取2 mL濃縮后的CTAB-GNR，加入4 mg Biotin-PEG-LA，室溫?cái)嚢?2 h，以6 800×g離心30 min，用去離子水洗滌3次，將所得沉淀保存于去離子水中，即得BPGNR。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，由于CTAB為帶正電荷的陽(yáng)離子化合物，而B(niǎo)iotin-PEG為帶微弱負(fù)電荷的高分子，因此可以通過(guò)GNR表面電位變化來(lái)判斷該修飾過(guò)程是否完成[12]。本試驗(yàn)用Zeta電位儀測(cè)定CTAB-GNR和BPGNR的電位，分別為+42.15 mV和-5.77 mV。修飾前后電位值的改變表明，GNR表面的CTAB被Biotin-PEG取代，即成功制得BPGNR。

2.2 PTXLA和CURLA的合成

2.2.1 PTXLA PTXLA為本試驗(yàn)首次合成。向25 mL圓底燒瓶中加入206.4 mg LA、191.9 mg EDC·HCl、122.1 mg DMAP、15 mL DCM，室溫?cái)嚢? h，加入856.2 mg PTX，繼續(xù)室溫?cái)嚢?4 h，旋干后，粗品用硅膠柱層析法進(jìn)行分離提純，以乙酸乙酯-正己烷（3 ∶ 2，V/V）為洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到淺黃色固體837.9 mg，產(chǎn)率為80.1%，測(cè)得熔點(diǎn)為193～196 ℃。用1H-NMR進(jìn)行表征，所得核磁數(shù)據(jù)為：1H-NMR（400 MHz，CDCl3），化學(xué)位移（δ，ppm）：8.12（d，J=7.3 Hz，2H），7.72（d，J=7.4 Hz，2H），7.60（t，J= 7.4 Hz，1H），7.50（t，J=8.0 Hz，3H），7.37（dt，J=29.7，9.3 Hz，7H），6.85（d，J=9.0 Hz，1H），6.28（s，1H），6.23（d，J=8.4 Hz，1H），5.95（dd，J=9.1，2.8 Hz，1H），5.67（d，J=7.0 Hz，1H），5.50（d，J=2.0 Hz，1H），4.96（d，J=8.2 Hz，1H），4.43（dd，J=10.7，6.7 Hz，1H），4.30（d，J=8.4 Hz，1H），4.19（d，J=8.3 Hz，1H），3.80（d，J=7.1 Hz，1H），3.47（dd，J=13.1，6.8 Hz，1H），3.21～3.02（m，2H），2.60～1.30（14H，m），2.44（s，3H），2.22（s，3H），1.93（s，3H），1.67（s，3H），1.23（d，J=7.6 Hz，3H），1.12（s，3H）。質(zhì)譜（MS）質(zhì)荷比（m/z）：1 043.376 0[M+H]+。PTXLA的合成路線圖見(jiàn)圖1A，1H-NMR圖見(jiàn)圖2A。

2.2.2 CURLA CURLA為本試驗(yàn)首次合成。向25 mL圓底燒瓶中加入206.5 mg LA，190.9 mg EDC·HCl，22.1 mg DMAP，15 mL THF，室溫?cái)嚢? h，加入372.6 mg CUR，繼續(xù)室溫?cái)嚢?8 h，旋干后，粗品用硅膠柱層析法進(jìn)行分離提純，以石油醚-乙酸乙酯（3 ∶ 2，V/ V）為洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到黃色固體425.4 mg，產(chǎn)率為75.3%，測(cè)得熔點(diǎn)為175～177 ℃。用1H-NMR進(jìn)行表征，所得核磁數(shù)據(jù)為：1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ（ppm）：7.61（d，J=2.5 Hz，1H），7.57（d，J=2.5 Hz，1H），7.17～7.08（m，3H），7.03（d，J=7.9 Hz，2H），6.92（d，J=8.2 Hz，1H），6.51（dd，J=23.1，15.8 Hz，2H），5.86（s，1H），5.82（s，1H），3.94（s，3H），3.86（s，3H），3.64～3.54（m，1H），3.15（dtd，J=17.8，11.1，6.7 Hz，2H），2.60（t，J=7.3 Hz，2H），2.47（td，J=12.4，6.4 Hz，1H），1.92（dq，J=13.7，7.1 Hz，1H），1.76（ddd，J=22.0，14.0，7.6 Hz，4H），1.67～1.43（m，4H）。MS（m/z）：557.166 7[M+H]+。CURLA的合成路線圖見(jiàn)圖1B，1H-NMR圖見(jiàn)圖2B。

2.3 PTXLA和CURLA的含量測(cè)定

2.3.1 PTXLA的色譜條件 PTXLA含量測(cè)定的色譜條件為本試驗(yàn)首次建立。色譜柱為安捷倫Zorbax反相色譜柱SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（3 ∶ 1，V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為 30 ℃，進(jìn)樣量為20 ?L，檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm。該色譜條件下，PTX、CUR和CURLA等其他成分和溶劑對(duì)PTXLA峰測(cè)定無(wú)干擾；用峰面積歸一化法測(cè)得PTXLA樣品中PTXLA的純度為99.2%；PTXLA的定量下限為0.09 μg/mL；精密度試驗(yàn)中峰面積的RSD=1.25%（n=5）；24 h穩(wěn)定性試驗(yàn)中峰面積的RSD=0.96%（n=5）；重復(fù)性試驗(yàn)中含量的RSD=1.78%（n=5）。

2.3.2 CURLA的色譜條件 CURLA含量測(cè)定的色譜條件為本試驗(yàn)首次建立。色譜柱為安捷倫Zorbax反相色譜柱SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-2%TFA（4 ∶ 1，V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 ?L，檢測(cè)波長(zhǎng)為426 nm。該色譜條件下，PTX、PTXLA和CURLA等其他成分和溶劑對(duì)CURLA峰測(cè)定無(wú)干擾；用峰面積歸一化法測(cè)得CURLA樣品中CURLA的純度為99.4%；CURLA的定量下限為0.07 μg/mL；精密度試驗(yàn)中峰面積的RSD=1.65%（n=5）；24 h穩(wěn)定性試驗(yàn)中峰面積的RSD=1.13%（n=5）；重復(fù)性試驗(yàn)中含量的RSD=1.86%（n=5）。

2.4 PTX/CUR-BPGNR的制備與表征

向10 mL圓底燒瓶中加入5 mL濃縮的BPGNR、8.0 mg PTXLA、5.0 mg CURLA，室溫避光攪拌24 h，反應(yīng)結(jié)束后，以6 800×g離心30 min，沉淀即為PTX/CUR-BPGNR，將沉淀用超純水洗滌3次后保存于去離子水中。未負(fù)載到GNR上的PTXLA和CURLA存在于上清液中，合并每次洗滌離心后的上清液，測(cè)定上清液中PTXLA和CURLA的量，計(jì)算PTX/CUR-BPGNR的載藥量=（加入量-上清液中測(cè)得量）/制劑總量×100%。結(jié)果顯示，PTX/CUR-BPGNR中PTX和CUR的載藥量分別為16.1%和8.4%。使用透射電子顯微鏡觀察PTX/CUR-BPGNR形貌，發(fā)現(xiàn)其大小、形狀比較均一，長(zhǎng)徑為51.5 nm，短徑為12.8 nm。使用紫外-可見(jiàn)光-NIR分光光度計(jì)檢測(cè)PTX/CUR-BPGNR光譜，可見(jiàn)其最大吸收波長(zhǎng)為808 nm。PTX/CUR-BPGNR的透射電子顯微鏡圖和紫外-可見(jiàn)光-NIR吸收光譜圖見(jiàn)圖3。

2.5 PTX/CUR-BPGNR體外釋藥試驗(yàn)

2.5.1 PTX的含量測(cè)定 PTX的色譜條件為本試驗(yàn)自行建立。色譜柱為安捷倫Zorbax反相色譜柱SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（1 ∶ 1，V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 ?L，檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm。該色譜條件下，CUR、PTXLA和CURLA等其他成分和溶劑對(duì)PTX峰測(cè)定無(wú)干擾；峰面積（A）對(duì)PTX質(zhì)量濃度（c）的回歸方程為A=34.987c+3.217 6（r=0.999 9，n=5），PTX檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.1～10.0 μg/mL；PTX的定量下限為0.05 μg/mL；加樣回收率為96.8%（n=6）；精密度試驗(yàn)中峰面積的RSD=1.06%（n=5）；24 h穩(wěn)定性試驗(yàn)中峰面積的RSD=1.17%（n=5）；重復(fù)性試驗(yàn)中含量的RSD=1.96%（n=5）。

2.5.2 CUR的含量測(cè)定 CUR的色譜條件為本試驗(yàn)自行建立。色譜柱為安捷倫Zorbax反相色譜柱SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-2%TFA（3 ∶ 2，V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為 30 ℃，進(jìn)樣量為20 ?L，檢測(cè)波長(zhǎng)為426 nm。該色譜條件下，PTX、PTXLA和CURLA等其他成分和溶劑對(duì)CUR峰測(cè)定無(wú)干擾；峰面積（A）對(duì)CUR質(zhì)量濃度（c）的回歸方程為A=129.94c+3.895（r=0.999 8，n=5），CUR檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.1～10.0 μg/mL；PTX的定量下限為0.03 μg/mL；加樣回收率為95.2%（n=6）；精密度試驗(yàn)中峰面積的RSD=1.32%（n=5）；24 h穩(wěn)定性試驗(yàn)中峰面積的RSD=1.78%（n=5）；重復(fù)性試驗(yàn)中含量的RSD=1.89%（n=5）。

2.5.3 體外藥物釋放考察 取1 mL的PTX/CUR-BPGNR水溶液（質(zhì)量濃度為40 μg/mL，以GNR計(jì)算）裝入透析袋內(nèi)（截留分子量3 500），放入10 mL以下4種釋放介質(zhì)中：①磷酸鹽緩沖液（PBS）+聚山梨酯80（0.5%，m/V，下同）；②PBS+聚山梨酯80+NIR光照（功率為5.0 W/cm2，20 min下同）；③PBS+聚山梨酯80+30 U/mL PLE（模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度酯酶環(huán)境）；④PBS+聚山梨酯80+NIR光照+30 U/mL PLE，37 ℃下水浴搖床中2 000 r/min振搖，分別于2、4、8、16、32、64 h取出 0.1 mL釋放介質(zhì)，然后補(bǔ)加等體積的相應(yīng)新鮮釋放介質(zhì)，在每次補(bǔ)加釋放介質(zhì)后，對(duì)第二組和第四組給予20 min NIR光照。測(cè)定釋放液中PTX和CUR的累積釋放度，繪制釋放曲線。4種介質(zhì)中PTX和CUR從PTX/CUR-BPGNR中的釋放曲線見(jiàn)圖4。

由圖4可以看出，當(dāng)分別給予NIR照射和PLE時(shí)，PTX/CUR-BPGNR釋放出游離的PTX和CUR的速度都加快。此外，當(dāng)同時(shí)給予NIR照射和PLE時(shí)，PTX和CUR的釋放速度最快，PTX和CUR的64 h累積釋放度分別可達(dá)37.2%、39.1%。這表明PTX/CUR-BPGNR的藥物釋放具有NIR和酯酶響應(yīng)性，能夠在NIR照射和腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度酯酶等刺激下加快釋放出游離PTX和CUR。

2.6 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

將MCF-7/ADR細(xì)胞接種于96孔板中，24 h后，棄舊培養(yǎng)基，分別加入含有BPGNR、PTX、CUR、PTX/CUR混合物（2 ∶ 1，m/m）、PTX/CUR-BPGNR（PTX、CUR、BPGNR質(zhì)量濃度分別為8、4、40 μg/mL）的培養(yǎng)基，并在加入藥物后2、4、8、16、32、64 h對(duì)各組細(xì)胞分別給予20 min NIR光照（功率為5.0 W/cm2），另將不作任何處理的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。所有細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每孔加入0.5 mg/mL的 MTT溶液 200 μL，避光孵育4 h后棄上清液，每孔加入200 μL二甲基亞砜溶解細(xì)胞內(nèi)甲臜晶體。用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率（以陰性對(duì)照為100%計(jì)）。試驗(yàn)重復(fù)3次。5種樣品的體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，BPGNR經(jīng)過(guò)NIR照射后，對(duì)細(xì)胞存活率影響較小，仍為95.8%，這表明在給定功率NIR光照下該質(zhì)量濃度的BPGNR對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞無(wú)明顯毒性。經(jīng)PTX和CUR處理的MCF-7/ADR細(xì)胞存活率分別為71.2%和91.9%，表明PTX對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞有較明顯毒性，而CUR對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞毒性較小。當(dāng)細(xì)胞暴露在PTX/CUR混合物中，細(xì)胞存活率顯著降低至45.8%，表明PTX和CUR聯(lián)用可增強(qiáng)對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的殺傷作用。PTX/CUR-BPGNR處理過(guò)的MCF-7/ADR細(xì)胞存活率僅為22.5%，表明PTX/CUR-BPGNR有很強(qiáng)抗MDR腫瘤的作用。

2.7 對(duì)P-gp表達(dá)的影響

將MCF-7/ADR細(xì)胞接種于12孔板中，24 h后，棄舊培養(yǎng)基，加入含PTX、CUR、PTX/CUR的混合物（2 ∶ 1，m/m）、PTX/CUR-BPGNR（PTX、CUR、BPGNR質(zhì)量濃度分別為8、4、40 μg/mL）培養(yǎng)基，并在加藥后2、4、8、16、32、64 h對(duì)各組細(xì)胞分別給予20 min NIR光照（功率為5.0 W/cm2），另將不作任何處理的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。所有細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞消化，離心洗滌，用反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞裂解上清液，按照P-gp ELISA檢測(cè)試劑盒操作，測(cè)定各組細(xì)胞中P-gp表達(dá)情況。以陰性對(duì)照MCF-7/ADR細(xì)胞的P-gp表達(dá)為100%計(jì)，經(jīng)PTX、CUR、PTX/CUR混合物、PTX/CUR-BPGNR處理后MCF-7/ADR細(xì)胞中P-gp的相對(duì)表達(dá)水平分別為105.6%、75.2%、73.8%、51.7%。可見(jiàn)CUR能顯著抑制MCF-7/ADR細(xì)胞中P-gp的表達(dá)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13-14]。 PTX/CUR-BPGNR對(duì)P-gp抑制作用最強(qiáng)，經(jīng)過(guò)其處理的MCF-7/ADR細(xì)胞中P-gp表達(dá)水平僅為未經(jīng)任何處理細(xì)胞的45.2%。這解釋了在細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，經(jīng)PTX/CUR-BPGNR處理過(guò)的MCF-7/ADR細(xì)胞存活率顯著降低的原因。

3 討論

PTX和CUR聯(lián)合治療用于提高腫瘤治療效果已有大量文獻(xiàn)報(bào)道[9-10，15]，但有關(guān)其腫瘤MDR效果評(píng)價(jià)的研究報(bào)道目前較少。本研究首次提出將PTX和CUR通過(guò)LA作為橋梁，將二者鍵合到GNR上，制備得到共輸送PTX和CUR的酯酶和NIR響應(yīng)的納米藥物輸送系統(tǒng)PTX/CUR-BPGNR。

接著筆者評(píng)價(jià)了PTX/CUR-BPGNR的體外藥物釋放行為、細(xì)胞毒性及其對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞P-gp表達(dá)的影響等。該載藥系統(tǒng)對(duì)較低功率NIR和模擬細(xì)胞內(nèi)濃度酯酶具有響應(yīng)性，在這些條件刺激下能加速釋放藥物。細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示，使用空白載體材料BPGNR在給定功率NIR照射下作用細(xì)胞，細(xì)胞存活率達(dá)到95.8%，這表明空白載體材料對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞毒性較小。在NIR照射下，PTX/CUR-BPGNR對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞有較強(qiáng)殺傷作用，細(xì)胞存活率僅為22.5%，起到較為顯著的抗腫瘤MDR效果。P-gp表達(dá)檢測(cè)則表明，CUR可抑制MCF-7/ADR細(xì)胞中P-gp表達(dá)水平，PTX/CUR-BPGNR可以提高CUR抑制P-gp表達(dá)的能力，從而起到增強(qiáng)抗MDR腫瘤效果。

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（收稿日期：2018-03-15 修回日期：2018-05-15）

（編輯：鄒麗娟）