穆曉玲

摘要 采用透析法制備PSA和PSSSA自組裝納米粒。用動態(tài)激光光散射（DLS）測得PSA和PSSSA的粒徑分別為189.53±9.42 nm和216.05±6.03 nm。體外細胞毒性和溶血性試驗結(jié)果表明，PSA和PSSSA載體在高濃度PSA（500 μg/ml）和PSSSA（500 μg/ml）下均無細胞毒性，且均具有良好的生物相容性。

關(guān)鍵詞 普魯蘭；藥物載體系統(tǒng)

中圖分類號：O657 文獻標識碼：A 文章編號：2095-3305（2018）02-019-02

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2018.02.009

普魯蘭多糖（pullulan）是1938年由R.Bauer發(fā)現(xiàn)的一種特殊的微生物多糖[1]，是一種由出芽短梗霉發(fā)酵所產(chǎn)生的類似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性粘質(zhì)多糖普魯蘭多糖，具有無毒、水溶性好以及表面易于修飾等特點，目前正被逐漸應用于納米藥物載體的研究中。然而對普魯蘭進行疏水化修飾制備納米藥物載體的研究很少，且與形成的載藥納米粒的毒性、細胞攝取和體內(nèi)生物效應相關(guān)的研究也很少[2]。

鑒此，文中采用透析法制備PSA和PSSSA自組裝水凝膠納米粒[3]，合成還原敏感的經(jīng)硬脂酸疏水改性的普魯蘭多糖，使其在水溶液中能夠自組裝形成納米粒子，并結(jié)合納米粒子體外細胞毒性試驗綜合評估其作為藥物載體的效果。

1 材料和方法

1.1 PSSSA和PSA自組裝水凝膠納米粒的制備

采用透析法制備PSA和PSSSA自組裝水凝膠納米粒：分別準確稱取10 mg PSSSA和PSA樣品溶于2 ml的DMSO中，然后轉(zhuǎn)移至透析袋（MWCO6000-8000），放置于1 L的超純水中透析48 h，前12 h每3 h換水1次，后36 h每隔8 h換水1次，將DMSO熔劑徹底透析干凈后，取出溶液，50 W超聲波清洗2 min，于10 ml容量瓶中定容。用0.45 μm濾膜過濾即得到PSA和PSSSA自組裝水凝膠納米粒。

1.2 PSA和PSSSA粒徑、Zeta電位、臨界膠束濃度（CMC）的測定

PSA和PSSSA自組裝納米粒的粒徑、Zeta電位和多分散指數(shù)（PDI）根據(jù)動態(tài)光散射原理（DLS），在室溫條件下用1 mg/ml濃度的PSA和PSSSA自組裝納米水凝膠通過納米粒度與Zeta電位分析儀測得，每個樣品測3次。采用穩(wěn)態(tài)熒光探針法來測量PSA和PSSSA的CMC。

1.3 PSA/DOX和PSSSA載藥納米粒的體外細胞試驗

1.3.1 MTT法檢測PSA和PSSSA載藥納米粒的細胞毒性 將指數(shù)生長期的COS-7細胞用細胞胰酶消化，調(diào)節(jié)細胞濃度為5×104個/ml，以200 μl/孔接種于96孔板，37℃，5% CO2培養(yǎng)24 h后加入一定濃度梯度的空白納米?；蜉d藥納米粒懸液于培基中，37℃，5% CO2培養(yǎng)48 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加100 μl MTT溶液（終濃度為0.5 mg/ml）于5%CO2，37℃培養(yǎng)4 h。小心吸去培養(yǎng)液并加入DMSO（100 μl/孔）溶解藍紫色的甲瓚，震蕩2 min待結(jié)晶充分溶解后用酶標儀測定570 nm的OD值，參考波長為630 nm，分別設計正常對照和空白對照（不加藥物為正常對照組，空白培養(yǎng)基為空白組），每個樣品平行測定3次，計算細胞存活率。公式為：

細胞存活率（%）=（OD損傷孔-OD損傷孔空白）/（OD對照孔-OD對照孔空白）×100%。

1.3.2 細胞溶血性試驗 取健康新西蘭大白兔新鮮血液8 ml，加入肝素抗凝，加入10 ml 0.9%生理鹽水稀釋，向1 ml的不同濃度PSSSA和PSA中加入100 μl稀釋血液，于37℃中溫育12 h，750 rpm離心5 min，加入2 ml乙醇/鹽酸，再750 rpm離心5 min，測其在398 nm處的吸光值。陰性對照為0.9%生理鹽水，陽性對照為水。公式為：

溶血率（%）=（OD樣品-OD陰性）/（OD陽性-OD陰性）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 PSA和PSSSA自組裝納米粒的基本性質(zhì)

從表1可以看出，透析法制備的PSA和PSSSA自組裝納米粒在超純水中的平均粒徑分別為189.53±9.42 nm和216.05±6.03 nm，Zeta電位分別為-12.9±0.3 mV和-10.4±0.4mV。結(jié)合作圖（圖1）計算得出PSA在膠束濃度 98.5 μg/ml以上時成球，PssSA在膠束濃度 133.35 μg/ml以上時成球，即可形成自組裝納米粒?？梢?，PSA的粒徑和CMC小于PSSSA，但其Zata電位大于PSSSA，這可能是由于PSSSA中加入了二硫鍵，使其電位降低。

2.2 PSSSA/DOX和PSSSA/DOX載藥納米粒的體外細胞試驗結(jié)果

2.2.1 細胞毒性能 利用COS-7細胞作為正常細胞組進行空白納米粒的毒性試驗，以便對載體的安全性能進行評估。從圖2可以看出，PSA與PSSSA在濃度達到500 μg/μl時，COS-7細胞的存活率均在90%以上，說明空白納米粒對COS-7細胞基本無毒，即PSA和PSSSA載體均具有良的生物相容性。同時還能看出隨著空白納米粒濃度的升高，細胞毒性逐漸加大。

2.2.2 細胞溶血性 利用新西蘭大白兔新鮮血液作為正常細胞組進行空白納米粒的溶血性試驗，從表2可以看出，隨著PSA空白納米粒濃度的增加，溶血率沒有出現(xiàn)特別明顯的趨勢變化；而隨著PSSSA空白納米粒濃度的增加，溶血率逐漸增加。

3 結(jié)論

（1）采用透析法制備經(jīng)硬脂酸修飾的普魯蘭多糖（Pullulan）衍生物PSA和PSSSA自組裝水凝膠納米粒，粒徑大小分別為189.53±9.42 nm和216.05±6.03 nm。經(jīng)穩(wěn)態(tài)熒光探針法測得PSA和PSSSA臨界膠束濃度分別為0.0 985 mg/ml和0.13 335 mg/ml。表明PSA和PSSSA衍生物在水溶液中均能夠自組裝形成水凝膠納米粒。

（2）MTT法測定的細胞毒性試驗結(jié)果顯示，當空白納米粒的濃度高達500 μg/μl時，COS-7細胞在48 h后存活率依然在90%以上；溶血性試驗中，PSA和PSSSA濃度達到1 mg/ml時，溶血率依然在5%左右，表明PSA和PSSSA載體均基本無毒，生物相容性較好。

參考文獻

[1] 王浩，張曉軍，沈佳佳，等. 一種新型的胞外多糖——普魯蘭[J]. 中國食品添加劑，2005（6）：60-63.

[2] 崔雙. 生育酚改性普魯蘭自組裝納米膠束用于抗癌藥物的傳遞[D].大連：大連理工大學，2013.

[3] 蔣麗琴. 膽固醇基普魯蘭自組裝納米粒與肝癌細胞相互作用的研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院；北京協(xié)和醫(yī)學院；中國醫(yī)學科學院；清華大學醫(yī)學部，2013.

責任編輯：劉赟