張麗香 郭全 郭遠(yuǎn)瑾 韋俊杰 李呂力 鐘維章 藺心敬 李燕華 李曉峰

〔摘要〕 目的 觀察溫腎健脾方對重癥肌無力（MG）脾腎陽虛型患者外周血B淋巴細(xì)胞亞群、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、B淋巴細(xì)胞活化因子（BAFF）表達(dá)的影響。方法 入選脾腎陽虛型MG患者18例為觀察組，同期健康體檢者20例為正常對照組，采用ELISA法檢測治療前、治療后IL-6、BAFF的水平，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測治療前、后外周血B淋巴細(xì)胞亞群比率。結(jié)果 MG患者IL-6、BAFF表達(dá)明顯高于正常對照組（P<0.01），溫腎健脾方治療1月后，MG患者IL-6、BAFF水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；MG患者治療前、后CD19+CD27+細(xì)胞百分比分別為（1.04±0.24）%、（0.96±0.28）%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），CD19+CD27-細(xì)胞百分比分別為（3.02±1.12）%、（2.12±0.42）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 溫腎健脾方對MG患者有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能與降低外周血中未分化B淋巴細(xì)胞數(shù)量及BAFF、IL-6水平有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 重癥肌無力；溫腎健脾方；B淋巴細(xì)胞亞群；IL-6；BAFF

〔中圖分類號〕R256.3；R746.1 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕B 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.024

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Wenshen Jianpi decoction on the immunologic function in spleen-kidney yang deficiency patients with myasthenia gravis. Methods 18 MG patients with spleen-kidney yang deficiency were selected as observation group and 20 healthy subjects were selected as normal control group in the same period. The levels of BAFF and IL-6 were measured by ELISA and the percentage of B lymphocyte subsets in peripheral blood was detected by flow cytometry before and after treatment. Results The expression of IL-6，BAFF in MG patients were significantly higher than the normal control group （P<0.01）. After Wenshen Jianpi decoction treatment for 1 month， the levels of IL-6 and BAFF in MG patients decreased significantly （P<0.01）. The percentage of CD19+CD27+ cells before and after treatment were （1.04±0.24）%， 0.96±0.28）%， the percentage of CD19+CD27- cells before and after treatment were （3.02±1.12）%，（2.12±0.42）%， the differences were ststistically significant（P<0.05）. Conclusion Wenshen Jianpi decoction has exact effects on immune regulation in patients with myasthenia gravis， and the mechanism may be related to reducing the number of undifferentiated B lymphocytes and the levels of BAFF and IL-6 in peripheral blood.

〔Keywords〕 myasthenia gravis； Wenshen Jianpi decoction； B lymphocyte subsets； IL-6； BAFF

重癥肌無力（myasthenia gravis， MG）是一種乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)、細(xì)胞免疫依賴、補(bǔ)體參與、以神經(jīng)-肌肉接頭傳遞功能障礙為特征的獲得性自身免疫性疾病。目前西醫(yī)多采用膽堿酯酶抑制劑、腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、靜脈注射免疫球蛋白、免疫吸附、血漿置換等治療，外科多采用胸腺切除法以及造血干細(xì)胞移植療法，治療方法雖多，但是副作用較大。既往的臨床觀察發(fā)現(xiàn)全身型MG患者多具有脾腎陽虛癥狀為主的中醫(yī)癥候特點(diǎn)[1-2]，在此基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用ELISA法檢測脾腎陽虛型MG患者外周血白細(xì)胞介素-6（lnterleukin 6，IL-6）、B淋巴細(xì)胞活化因子（b-cell activating factor，BAFF）水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測B淋巴細(xì)胞亞群分布變化，探討溫腎健脾方對MG患者的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 觀察對象

MG病例來源系廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院2010年10月至2013年10月期間神經(jīng)內(nèi)科門診及住院患者，根據(jù)中國神經(jīng)免疫學(xué)會診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]確診MG；按照中醫(yī)脾腎陽虛癥候：眼瞼下垂，復(fù)視，咀嚼、抬頸無力，四肢倦怠無力，畏寒肢冷，吞咽困難，面色白，腹部冷痛，久泄久痢或便溏、完谷不化，小便清長，或浮腫少尿，舌淡胖，苔薄白或白滑，脈沉遲無力或脈沉細(xì)，入選脾腎陽虛型新發(fā)病MG患者18例，按照改良Osserman臨床分型[4]，Ⅱa型5例、Ⅱb型13例；排除激素、免疫抑制劑治療史以及其他自身免疫性疾病，其中男6例，女12例，年齡（35.6±8.4）歲。對照組為同期健康體檢者20例，其中男8例，女12例，年齡（34.2±9.4）歲，無自身免疫性疾病，近期內(nèi)未服用影響免疫功能藥物。兩組性別、年齡、民族差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），所有受檢者均知情同意研究內(nèi)容后納入。

1.2 治療方法

（1）溴吡啶斯的明：根據(jù)患者病情嚴(yán)重程度，分別從60 mg每日3次至120 mg每日4次，長期規(guī)律口服；（2）中藥治療： 患者經(jīng)中醫(yī)辨證診斷后口服溫腎健脾方（補(bǔ)中益氣湯、金匱腎氣湯加減）：黃芪60 g，黨參30 g，白術(shù)15 g，當(dāng)歸15 g，陳皮15 g，柴胡15 g，升麻15 g，熟地黃15 g，山萸肉25 g，菟絲子25 g，山藥15 g，牛膝10 g，制附子3 g，丹皮6 g，澤瀉6 g，鹿角12 g，巴戟25 g，甘草6 g。每日1劑，療程1個月。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

治療前、治療1月后分別檢測患者外周血IL-6、BAFF水平及B淋巴細(xì)胞亞群比率。

1.3.1 IL-6、BAFF水平測定 所有受試者均于清晨空腹采血6 mL，其中1 mL離心取上清，置于EP管內(nèi)-80 ℃保存，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對所有標(biāo)本一次性進(jìn)行測定，所有試劑盒均由Rapidbio Lab提供，嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求程序進(jìn)行操作。酶標(biāo)儀（GF-M3000型酶標(biāo)儀）450 nm 處測A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算BAFF和IL-6濃度值。

1.3.2 B淋巴細(xì)胞亞群比率測定 受試者靜脈血5 mL，置于肝素鈉抗凝管，加入等倍磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋，緩慢加于人淋巴細(xì)胞分離液之液面上，以3 000 r/min離心15 min，收集第二層細(xì)胞（淋巴細(xì)胞），1% PBS反復(fù)洗滌2次，計數(shù)后取100 μL細(xì)胞懸液加入相關(guān)表面抗體及同型對照抗體5 μL，4 ℃避光孵育30 min，常溫下用2 mL 1%PBS洗2次，加入300 μL 1%多聚甲醛固定，4 h內(nèi)行流式細(xì)胞儀檢測。上機(jī)收集1×104個細(xì)胞，使用Cell Quest軟件分析陽性細(xì)胞百分率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以“x±s”表示，治療前后進(jìn)行配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組MG患者外周血IL-6和BAFF水平

治療前脾腎陽虛型MG患者外周血中IL-6、BAFF的水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），溫腎健脾方治療1月后，MG患者IL-6、BAFF水平均明顯下降（P<0.01），見表1。

2.2 兩組MG患者溫腎健脾方治療前后B淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)

治療前脾腎陽虛型MG患者外周血CD19+CD27+細(xì)胞表達(dá)及CD19+CD27-細(xì)胞表達(dá)明顯高于對照組（P<0.01），溫腎健脾方治療后CD19+CD27+細(xì)胞表達(dá)較治療前略下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；CD19+CD27-細(xì)胞表達(dá)較治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

MG主要臨床表現(xiàn)為骨骼肌無力、易疲勞、晨輕暮重，活動后加重，休息后或服用膽堿酯酶抑制劑后減輕等特點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)并無重癥肌無力病名診斷，根據(jù)該病臨床表現(xiàn)歸屬中醫(yī)“萎證”范疇。病位在脾腎肝，以虛多見。脾主運(yùn)化，主肌肉，脾虛則運(yùn)化和散精功能失常，水谷精微內(nèi)不能供養(yǎng)五臟六腑，外不能濡養(yǎng)肌肉關(guān)節(jié)；腎主藏精，主生長發(fā)育，腎虛則臟腑功能減退，筋骨痿軟乏力。根據(jù)國內(nèi)文獻(xiàn)報道[5]，應(yīng)用補(bǔ)中益氣湯治療MG取得較好的臨床療效，但具體機(jī)制尚不清楚。

脾腎陽虛證型是臨床全身型MG最常見病證類型，常發(fā)生于MG發(fā)病進(jìn)程中。根據(jù)脾腎陽虛的病機(jī)特點(diǎn)，當(dāng)循“虛者補(bǔ)之”“損者益之”，治法以健脾益腎為主，在補(bǔ)益脾胃藥中加溫補(bǔ)腎陽之品?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》提出“治痿獨(dú)取陽明”，在此基礎(chǔ)上后世醫(yī)家對痿證的病因、病機(jī)研究更加深入，北宋時期的竇材將痿證的發(fā)病歸之于腎，提出溫補(bǔ)腎陽、壯火起痿等治法，明代《普濟(jì)方》記載了金剛丸、牛膝丸等治療“肝腎不足”之痿證。溫腎健脾方源自補(bǔ)中益氣湯、金匱腎氣湯加減而成，方中黃芪、黨參、茯苓、甘草、白術(shù)、山藥、陳皮健脾益氣，柴胡、升麻升陽舉陷，鹿角、巴戟天、制附子、菟絲子、牛膝、山萸肉溫補(bǔ)腎陽，熟地黃、丹皮、澤瀉滋補(bǔ)肝腎陰虛?？v觀全方，共奏健脾益氣、溫補(bǔ)腎虛之效。

人體外周血中B細(xì)胞亞群主要為未活化的未成熟B細(xì)胞、初始B細(xì)胞以及活化的記憶性B細(xì)胞、漿母細(xì)胞[6]。CD19+CD27-細(xì)胞標(biāo)記了未活化的未成熟B細(xì)胞及初始B細(xì)胞，而CD19+CD27+細(xì)胞標(biāo)記了活化的記憶性B細(xì)胞及漿母細(xì)胞。既往研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，BAFF主要表達(dá)在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、生長因子刺激的中性粒細(xì)胞和活化的T細(xì)胞表面，BAFF信號對T淋巴細(xì)胞的活化發(fā)揮著共刺激作用。BAFF過度表達(dá)可以導(dǎo)致B細(xì)胞嚴(yán)重增生、降低B細(xì)胞的耐受性，促進(jìn)體內(nèi)自身抗體產(chǎn)生，產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)[9]。II-6可促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化和分泌抗體，在活化、增殖的B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞的過程中起關(guān)鍵作用。既往的研究中發(fā)現(xiàn)，新發(fā)病MG患者，尤其是Ⅱb型和Ⅲ型患者中，IL-6、BAFF表達(dá)一致性增高[10]。Dalakas等[11-12]研究也證實(shí)，MG患者BAFF表達(dá)明顯增高，T、B淋巴細(xì)胞在MG發(fā)病中具有協(xié)同作用， 控制B淋巴細(xì)胞的功能異常是治療MG的關(guān)鍵。國內(nèi)研究表明[13]，以黃芪、黨參、茯苓、甘草、白術(shù)為主的健脾益氣為主的中藥，有助于抑制B淋巴細(xì)胞代謝和增殖，具有調(diào)節(jié)體液免疫功能。本研究發(fā)現(xiàn)，脾腎陽虛型MG患者外周血CD19+CD27-細(xì)胞及BAFF表達(dá)明顯增高，提示MG患者體內(nèi)存在B細(xì)胞亞群功能紊亂，由于CD19+CD27-細(xì)胞代表未活化B細(xì)胞，BAFF能促進(jìn)B細(xì)胞活化增殖，并延緩其凋亡，MG患者體內(nèi)未活化B細(xì)胞增高可能是由于BAFF表達(dá)增加所致，這些增多的未活化B細(xì)胞會進(jìn)一步被激活為活化B細(xì)胞，參與MG的發(fā)??；以補(bǔ)中益氣湯為基礎(chǔ)的溫腎健脾方能夠降低MG患者CD19+CD27-細(xì)胞及BAFF、IL-6表達(dá)水平，但CD19+CD27+細(xì)胞的表達(dá)在治療前后無明顯變化，由于MG患者免疫功能障礙機(jī)制復(fù)雜，抑制未活化B細(xì)胞表達(dá)并不能完全糾正患者體內(nèi)的免疫功能紊亂。Lebrun等[14]研究發(fā)現(xiàn)，利妥昔單抗能有效抑制MG的復(fù)發(fā)，通過監(jiān)測重新出現(xiàn)的CD27+記憶B細(xì)胞，可安全降低利妥昔單抗給藥頻率。提示MG患者外周血CD27+細(xì)胞亞群的作用仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，脾腎陽虛型MG患者存在以CD19+CD27-細(xì)胞及BAFF表達(dá)增高為特征的免疫功能紊亂，溫腎健脾方可能通過抑制BAFF、IL-6的表達(dá)，降低未活化B細(xì)胞的比率，從而發(fā)揮對MG的免疫調(diào)節(jié)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李曉峰，李呂力，羅永堅，等.重癥肌無力患者IL-18、TGFβ-1的表達(dá)[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志，2010，36（7）：393-396.

[2] 呂志國，王 健，徐 鵬，等.基于專家共識法的重癥肌無力中醫(yī)證候篩選研究[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2017，19（1）：1-6.

[3] 李柱一，許賢豪，劉建軍，等.第八屆全國神經(jīng)免疫會議紀(jì)要[J].中華神經(jīng)科雜志，2005，38（2）：128.

[4] 陳灝珠.實(shí)用內(nèi)科學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：2490-2493.

[5] 蔣旭宏，黃小民，章正祥，等.裘昌林教授治療重癥肌無力的用藥規(guī)律探究[J].中國中醫(yī)急癥雜志，2016，25（3）：428-432.

[6] KOHLER S， KEIL T O， SWIERZY M， et al. Disturbed B cell subpopulations and increased plasma cells in myasthenia gravis patients[J]. J euroimmunol，2013，264（1-2）：114-119.

[7] KANG S Y， KANG C H， LEE K H. B-cell-activating factor is elevated in serum of patients with myasthenia gravis[J]. Muscle Nerve，2016，54（6）：1030-1033.

[8] LISAK R P， RAGHEB S. The role of B cell-activating factor in autoimmune myasthenia gravis[J]. Ann N Y Acad Sci，2012，1274（1）：60-67.

[9] COMABELLA M. Neuroimmunology： B cells and variant BAFF in autoimmune disease[J]. Nat Rev Neurol，2017，13（8）：453-454.

[10] 李曉峰，李呂力，羅永堅，等.重癥肌無力患者血清B淋巴細(xì)胞刺激因子、IL-6水平檢測及臨床意義[J].中國老年學(xué)雜志，2010，30（14）：1938-1939.

[11] DALAKAS M C. Novel future therapeutic options in myasthenia gravis[J]. Autoimmun Rev， 2013，12（9）：936-941.

[12] BERRIH-AKNIN S， RAGHEB S， LE PANSE R， et al. Ectopic germinal centers， BAFF and anti-B-cell therapy in myasthenia gravis[J]. Autoimmun Rev，2013，12（9）：885-893.

[13] 吳玉霞，黃志惠，袁 忠，等.健脾益氣攝血顆粒對脾氣虛型慢性免疫性血小板減少癥淋巴細(xì)胞亞群的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2016，36（9）：65-68.

[14] LEBRUN C， BOURG V， BRESCH S， et al. Therapeutic target of memory B cells depletion helps to tailor administration frequency of rituximab in myasthenia gravis[J]. J Neuroimmunol， 2016，298：79-81.