李文沛 俸婷婷 周英

摘 要：研究金銀花、山銀花提取物的體外抑菌、體內(nèi)解熱和抗內(nèi)毒素作用以及對用藥安全性進行探討。采用微量肉湯法測定提取物對供試菌株的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）；通過建立大鼠內(nèi)毒素LPS熱毒血癥模型測定大鼠下丘腦cAMP、AVP和血液中ET含量變化研究提取物解熱和抗內(nèi)毒素能力；通過建立大鼠致敏模型測定血液中IgE比較用藥安全性。結(jié)果表明提取物對除白色念珠菌外的供試菌株具有較好的抑制作用，有很好的體內(nèi)解熱和抗內(nèi)毒素作用，安全性結(jié)果表明高劑量的灰氈毛忍冬提取物會導(dǎo)致大鼠過敏。證實金銀花、山銀花具有較好的抑菌活性、解熱和抗內(nèi)毒素作用，高劑量用藥存在過敏風(fēng)險。

關(guān)鍵詞：金銀花；抑菌作用；cAMP；ET；IgE

中圖分類號：R2855

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2018）04-0089-006 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.04.014

Study on the pharmacodynamics and safety of Flos lonicerae japonicae and Flos lonicerae

LI Wenpei1，2，3，F(xiàn)ENG Tingting2，3，ZHOU Ying2，3*

（1.College of Pharmacy， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China； 2. Guizhou Traditional Chinese Medicine and Ethnic Drug Engineering Center， Guiyang， Guizhou 550025， China； 3. Guizhou Medicine Edible Plant Resources Research and Development Center， Guiyang， Guizhou 550025， China）

Abstract：he bacteriostatic， antipyretic and anti/endotoxin effect of extracts from Flos lonicerae japonicae and Flos lonicerae was studied and the safety of using them as medicine discussed. The minimal inhibitory concentration （MIC） and minimal bactericidal concentration （MBC） of the extracts against tested microbes were determined by microbroth method. The content changes of hypothalamic cAMP and AVP and ET in blood were determined by establishing a rat model of endotoxin LPS hyperthermia in order to study the antipyretic and anti-endotoxin ability of the extract. The safety of IgE in blood was determined through a rat allergic model. The results showed that the extract of Flos lonicerae japonica and Flos lonicerae has good antipyretic and anti-endotoxin effect and better inhibitory effect on the tested microbes except Candida albicans. Safety results showed that high dose of the extract could lead to anaphylaxis.

Key words：Flos lonicerae japonica； antibacterial； cAMP；antipyretic； anti-endotoxin.

金銀花（Flos lonicerae japonica ）與山銀花（Flos lonicerae）是忍冬科忍冬屬植物干燥的花蕾或帶初開的花，其中忍冬（Lonicera Japonica Thunb）被列為金銀花唯一的藥源植物，其余收錄在山銀花中。兩者都具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱之功效，主要用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等癥[1]。近年來研究表明金銀花具有廣譜抗菌、抗病毒、增強免疫力，抗氧化，解熱抗炎、保肝、降血糖、抗腫瘤[2-5]等多種藥理作用。研究表明在致熱源可導(dǎo)致體溫調(diào)節(jié)中樞的調(diào)定點上移引起發(fā)熱，cAMP是調(diào)節(jié)體溫的重要的中樞制熱介質(zhì)，與體溫呈正相關(guān)[6]，精氨酸加壓素（AVP）是由下丘腦合成的九肽神經(jīng)肽，與體溫升高呈負反饋調(diào)節(jié)，測定下丘腦中的cAMP、AVP含量變化能在一定程度上反映藥物對體溫調(diào)節(jié)中樞的作用[7]。免疫球蛋白E（IgE）是臨床判斷超敏反應(yīng)的重要指標(biāo)[8]，為探討金銀花、山銀花用藥的安全性，擬建立動物制敏模型，與模型組比較評價其安全性。本實驗以忍冬、黃褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa Hsu et SCCheng）、灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides）[9]的水提物與70%乙醇提物為研究對象，分別觀察其體外對常見病原菌的抑制作用，進行體內(nèi)解熱、抗內(nèi)毒素及安全性實驗，為研制中藥制劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

11 供試菌株

金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003；白色念珠菌CMCC（B）98001；變形桿菌CMCC（B）49027；枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501；大腸桿菌CMCC（B）44289；銅綠假單胞菌CMCC（B）10104（中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心）；糞腸球菌ATCC 29212（美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫）。

12 供試藥材

黃褐毛忍冬：安農(nóng)德臥（安龍縣德臥鎮(zhèn)大水溝村提供）

忍冬：巨花一號（安順市鎮(zhèn)寧縣黃果樹采摘）

灰氈毛忍冬：綏陽灰氈（綏陽縣茅婭鎮(zhèn)擁德村龍二組提供）。

13 藥物與試劑

營養(yǎng)瓊脂（上海博微生物技術(shù)有限責(zé)任公司 批號：170405），營養(yǎng)肉湯（杭州百思生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20170701001），青霉素鈉（北京哈藥責(zé)任有限公司，批號：080091248），NEST96孔板（海門市春博生物實驗器材廠，批號：071017A005），胎牛血清50 mL（浙江天航生物科技股份有限公司，批號：11011-8611），內(nèi)毒素LPS（合肥博美生物有限公司，Sigma L2880），大鼠環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、精氨酸加壓素（AVP）、內(nèi)毒素（ET）、免疫球蛋白E（IgE）ELISA檢測試劑盒（安徽萊爾科技有限公司），一次性負壓采血管（山東省成武縣醫(yī)療制品廠，批號：20170402）。

14 實驗儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號YQX-LS-50SⅡ）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（北京科偉永興儀器有限公司，型號：HWS-150）、冰箱（青島海爾股份有限公司，型號：GB 120212-2008）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，型號：WGL-685）、超凈工作臺（天津市泰斯特儀器有限公司，型號：CJ-2D）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司，型號：ZWYR-2012C）。

15 實驗動物

清潔級SD大鼠，體重230～260 g。（購于成都動物培養(yǎng)所）。

16 體外抑菌試驗方法

161 金銀花、山銀花水提物、70%乙醇提取物的制備

水提取物的制備 稱取不同品種的干燥藥材50 g，以料液比1∶8加入蒸餾水，煮沸回流提取90 min收集濾液，同法將藥渣煮沸回流提取2次。合并濾液，減壓濃縮成浸膏后冷凍干燥，稱取冷凍干燥的提取物加蒸餾水配置成2048 g/mL的待測藥液即為水提取物。同法制備70%乙醇提取物，動物實驗提取物料液比為1∶20。

162 實驗菌懸液的制備

配置營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基并分裝于150 mL三角瓶，置于滅菌鍋高溫高壓滅菌20 min冷卻待用。在無菌操作臺內(nèi)用灼燒后的接種環(huán)挑取凍干菌粉末置于預(yù)先冷卻待用的無菌液體培養(yǎng)基內(nèi)，搖晃均勻放置在37℃的100 r/min的搖床培養(yǎng)24 h。取1 mL菌液稀釋1×106、1×107、1×108均勻涂布在無菌瓊脂平板培養(yǎng)18 h進行菌落計數(shù)，計算合適稀釋倍數(shù)使菌落數(shù)約為2×106CFU/mL。

163 最低抑菌濃度（MIC）與最低殺菌濃度（MBC）的測定

根據(jù)CLSI推薦的微量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度MIC，在超凈工作臺內(nèi)取一次性無菌96孔板，設(shè)置實驗組A1～A9；陽性組A10；正常組A11；空白組A12。除第一列外，向A1～A9孔各加入100 μl營養(yǎng)肉湯，向第一列A1～A9加入200 μl待測藥液，從第一列孔吸取100 μl藥液加入第二列混勻吸取100 μl加入第三列直至第八列依次倍半稀釋，從第八列吸取100 μl棄去。再吸取100 μl配置好的菌懸液加入各孔中混勻，使A1～A9藥液濃度為1024、512、256、128、64、32、16、8、4 mg/mL，菌濃度為1×106 CFU/mL。A10孔中加入2萬單位的青霉素鈉100 μl和100 μl營養(yǎng)肉湯，A11孔加入100 μl營養(yǎng)肉湯和100 μl的菌懸液，A12孔加入200 μl的營養(yǎng)肉湯，使每孔均為200 μl。將96孔板放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后取出，觀察讀取MIC，以與澄清透光組對應(yīng)的最低濃度孔為MIC。從上述各孔中吸取100 μl加到預(yù)先配置好的無菌營養(yǎng)瓊脂平板內(nèi)，各濃度設(shè)置4個平行板，用灼燒冷卻后的涂布棒均勻涂板，然后放置在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h，取出觀察，以肉眼觀察沒有菌落或者菌落數(shù)少于5個的孔對應(yīng)的最低藥液濃度作為MBC。

17 解熱與抗內(nèi)毒素試驗方法

171 LPS熱毒血癥模型建立

根據(jù)《中國藥典》2015年版金銀花、山銀花的人的臨床劑量，計算實驗大鼠臨床劑量約為135 g/kg（生藥量），設(shè)置低、中、高劑量藥物濃度梯度，低劑量組為5倍臨床劑量675 g/kg，中劑量組為10倍臨床劑量135 g/kg，高劑量組為20倍濃度臨床劑量27 g/kg。取168只SD大鼠分為21組，每組8只雌雄各半。第一至九組分別為三種藥材水提物高中低劑量，第十至十八組分別為三種藥材70%乙醇提物高中低劑量，十九組為LPS模型組，二十組為板藍根組給予675 g/kg（生藥量）板藍根沖劑，二十一組為正常組給予生理鹽水灌胃。前二十組每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥6天，第6天給藥之后禁食不禁水過夜，第7天給藥后1小時各組腹腔注射LPS內(nèi)毒素100 μg/kg造模。

172 大鼠下丘腦cAMP、AVP含量測定

發(fā)熱高峰6 h將大鼠斷頭法處死，于冰浴下迅速取出全腦，于視交叉與灰結(jié)節(jié)之間取下丘腦組織。稱取 50 mg 新鮮下丘腦組織，加入細胞裂解液05 mL，室溫裂解30 min。超聲裂解1 min后4℃、13000 r/min離心15 min，取上清液采用雙抗體夾心ELISA 法測定cAMP、AVP含量，按試劑盒說明操作進行測定。

173 大鼠血清內(nèi)毒素ET含量測定

發(fā)熱高峰6 h用乙醚將大鼠麻醉，采用腹腔主動脈取血法，用一次性負壓肝素鈉管取血5 mL，3000 r/min離心05 h，取上清。采用雙抗體夾心ELISA 法測定血液ET含量，測定方法按試劑盒說明操作。

18 安全性實驗方法

181 大鼠過敏模型建立

參照國家食品藥品監(jiān)督管理局《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》設(shè)置金銀花與山銀花水提物低、高藥物濃度梯度，低濃度為臨床劑量5倍（675 g/kg），高劑量為臨床劑量10倍（135 g/kg）。取64只SD大鼠，分為8組，每組6只雌雄各半。第一至六組分別為三種藥材提取物低、高濃度，第七組為過敏模型，第八組為正常對照組。第一至六組每天灌胃給藥一次連續(xù)給藥10天，第七組采用大鼠尾靜脈推注10 mg/mL的胎牛血清1 mL，隔日給藥方式。第八組尾靜脈推注生理鹽水1 mL。

182 大鼠免疫球蛋白IgE測定

末次給藥10 h后用乙醚將大鼠麻醉，采用腹腔主動脈取血法，用一次性負壓肝素鈉管取血5 mL以上，3000 r/min離心05 h，取上清。采用雙抗體夾心ELISA 法測定血液IgE含量，測定方法按試劑盒說明操作。

19 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用STATVIEW 統(tǒng)計軟件進行ANOVA 和 t-tests分析，當(dāng)P<005時認為結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

21 金銀花、山銀花提取物抑菌結(jié)果

供試的三種中藥材在實驗設(shè)計濃度下的體外抑菌結(jié)果見表1、表2。

結(jié)果顯示：水提物的抑菌作用要明顯優(yōu)于70%乙醇提取物抑菌作用。金銀花、山銀花的抑菌作用有明顯差異，供試藥材抑菌強弱順序：巨花一號>安農(nóng)德臥>綏陽灰氈。金銀花、山銀花提取物對白色念珠菌均無抑制作用，對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有較好的抑菌作用。

22 金銀花、山銀花解熱作用結(jié)果

表3結(jié)果顯示：與模型組比較正常組（P<001）說明造模成功。與模型組比較各組具有顯著性差異（P<005）說明提取物均有抑制下丘腦cAMP升高的作用，其中綏陽灰氈低、中、高劑量組與模型組比較表現(xiàn)出極顯著差異（P<001）。

表4結(jié)果顯示：與模型組比較正常組（P<001）說明造模成功。與模型組比較各組標(biāo)出極顯著性差異（P<001），從下丘腦AVP含量上看實驗各組均大于模型組，說明提取物均有促進抗利尿激素AVP升高的作用，其中70%乙醇綏陽灰氈毛忍冬高劑量組對促進抗利尿激素升高效果最好。

23 金銀花、山銀花抗內(nèi)毒素作用結(jié)果

表5結(jié)果顯示：與模型組比較正常組（P<001）說明造模成功。與模型組比較各組表現(xiàn)出極顯著性差異（P<001），說明各組都有明顯的抗內(nèi)毒素作用。其中巨花一號水提物與醇提物對ET清除作用相當(dāng)，安農(nóng)德臥和綏陽灰氈70%乙醇提取對ET的清除要效果優(yōu)于水提物的清除效果，其中綏陽灰氈醇提物高劑量組對內(nèi)毒素ET的清除效果最佳。

24 金銀花、山銀花體內(nèi)過敏實驗結(jié)果

表6結(jié)果顯示：與過敏模型組比較正常組（P<001）說明造模成功，除綏陽灰氈高劑量組外與模型組（P<001）表現(xiàn)出極顯著差異，與正常組比較巨花一號高劑量與綏陽灰氈高劑量組（P<001）表現(xiàn)出極顯著差異，血清IgE含量比較，巨花一號高劑量組血清IgE含量小于正常組表明未引起過敏反應(yīng)，綏陽灰氈高劑量組血清IgE含量明顯高于正常對照組，交叉對比說明綏陽灰氈高劑組引起機體過敏反應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

文獻中記錄金銀花和山銀花在體外抑菌活性上存在差異，經(jīng)閱讀文獻比較發(fā)現(xiàn)體外抑菌實驗影響因素較多，其中主要影響因素為藥材產(chǎn)地、試驗方法、提取工藝、供試菌濃度、中藥材提取部位等[10]，本實驗中金銀花、山銀花均取自貴州本地，可為本地相關(guān)研究提供參考。本研究表明金銀花、山銀花解熱作用和抗內(nèi)毒素作用存在明顯差異，其中忍冬和灰氈毛忍冬的解熱效果優(yōu)于黃褐毛忍冬，灰氈毛忍冬抗內(nèi)毒素作用優(yōu)于忍冬，推測由于金銀花與山銀花在化學(xué)成分含量方面存在差異，灰氈毛忍冬中綠原酸類化合物含量明顯高于金銀花[11]，綠原酸有較高清除自由基作用，而金銀花較山銀花含有較多木犀草苷[12-13]，木犀草苷能顯著提高自由基，金銀花與山銀花的藥效是綠原酸、揮發(fā)油、黃酮類、三萜皂甙等多種成分共同作用的結(jié)果。過敏實驗結(jié)果顯示高劑量的灰氈毛忍冬提取物會引起小鼠超敏反應(yīng)，高劑量的忍冬提取物并未引起過敏，在精細醫(yī)療中不可選擇有潛在用藥風(fēng)險的山銀花，另外木犀草苷中某些成份濃度過高會對正常細胞（如人體肺胚胎纖維原細胞、人體臍帶血管內(nèi)皮細胞）有毒副性作用[14]，因此用藥劑量及不同中藥材混用需要更多探討；此外中國是濫用抗生素最嚴(yán)重的國家之一，不合理的使用抗生素會對人體帶來巨大負擔(dān)同時產(chǎn)生更多耐藥菌種，開發(fā)中藥抗生素替代品具有巨大的應(yīng)用前景[15]，本文旨為金銀花、山銀花的臨床開發(fā)與應(yīng)用提供參考。

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