陳芳芳 曹曦躍 劉穎 劉夢佳 顏佳超 楊富強 曹毅 喬代蓉

摘 要：從短小芽孢桿菌中克隆阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43并重組表達，有利于將該酶分離純化后應(yīng)用于其他半纖維素多糖的水解。該研究利用E. coli BL21表達系統(tǒng)對實驗室克隆到的短小芽孢桿菌的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43進行重組表達并分析其酶學(xué)性質(zhì)，將重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43和來源于棒曲霉突變菌株的商業(yè)木聚糖酶聯(lián)合作用于燕麥木聚糖。結(jié)果表明：以燕麥木聚糖為底物，重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43的最適溫度為50 ℃，最適pH為6.0。該酶在pH 5.0～10.0和45～55 ℃下較穩(wěn)定。與木聚糖酶單獨作用相比，重組Xyn43酶與商業(yè)木聚糖酶同時加入以及先用木聚糖酶水解后加入Xyn43酶，水解產(chǎn)物中的還原糖含量分別增加了16%和20%，木糖含量增加了35%和48%。該結(jié)果研究結(jié)果表明重組Xyn43酶能夠和商業(yè)木聚糖酶協(xié)同降解燕麥木聚糖，提高水解效率，產(chǎn)生更多的木寡糖，阿拉伯糖和木糖。

關(guān)鍵詞：α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶， 木聚糖酶， 燕麥木聚糖， 重組表達， 協(xié)同作用

中圖分類號：Q946

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）04-0444-07

Abstract：Hemicellulose is a rich renewable resource， which is one of the most promising raw materials for the production of biofuels. α-L-arabinofuranosidase （EC 3.2.1.55） is an auxiliary enzyme in hemicellulose hydrolase system which catalyzes the α-L-1，2， α-L-1，3 and α-L-1.5-arabinofuranoside residues in non-reducing terminal of various oligosaccharides and polysaccharides. Bacillus pumilus is a widely used， bio-friendly feed microbial strain that can degrades mannan， xylan， cellulose and so on. Therefore， cloning the α-L-arabinofuranosidase gene xyn43 from B. pumilus and recombinant expression is beneficial to the separation and purification of the enzyme and it can be applied to the hydrolysis of other hemicellulose polysaccharide. In this study， we used the E. coli BL21 expression system to express the α-L-arabinofuranosidase gene xyn43 isolated from the B. pumilus and then analyzed the enzymatic properties of recombinant enzyme Xyn43. And we used Xyn43 and commercial Xylanase derived from the mutant strain of Aspergillve clavatus to degrade the oat spelt xylan. The results showed that the optimal temperature of Xyn43 was 50 ℃ and the optimum pH was 6.0. It was stable over a pH range of 5.0 -10.0 and temperatures of 45-55 ℃. Compared with Xylanase alone， the reducing sugar content in the hydrolyzate of Xyn43 and Xylanase added simultaneously and Xyn43 added after Xylanase increased 16% and 20% respectively， and the xylose content increased of 35% and 48%. The studies indicate that Xyn43 is able to synergistically with commercial Xylanase for oat spelt xylan degradation and can improve the hydrolysis efficiency， produced more xylosaccharides， arabinose and xylose.

Key words：α-L-arabinofuranosidase， xylanase， oat spelt xylan， recombinant expression， synergistic effect

半纖維素是植物細胞壁結(jié)構(gòu)中含量僅低于纖維素的第二大碳水化合物高聚物，不同于均多糖纖維素，它是由戊糖（D-木糖， L-阿拉伯糖），己糖（D-葡萄糖， D-半乳糖， D-甘露糖）和一些酸性多糖（半乳糖醛酸和葡糖醛酸）等不同類型單糖組成的雜多糖（余紫蘋等，2011）。通過生物技術(shù)方法能夠?qū)⑦@些低成本的生物質(zhì)轉(zhuǎn)變成有價值的產(chǎn)品，如乙醇和工業(yè)化學(xué)品等，因此半纖維素有著巨大的潛在利用價值，被認為是生產(chǎn)生物燃料的最有前景的原料之一（朱晨杰等， 2015）。由于半纖維素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其完全水解需要多種酶的共同參與，主鏈水解酶內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶（EC 3.2.1.8）水解β-1，4-木糖苷鍵釋放木二糖，β-木糖苷酶（EC 3.2.1.37）從木二糖和短鏈低聚木糖中釋放出木糖。半纖維素中大量取代基的存在阻礙了主鏈水解酶的降解，一些木聚糖酶不切割被取代的木糖單元之間的糖苷鍵，因此在主鏈完全水解之前側(cè)鏈必須裂解。木聚糖上的L-阿拉伯呋喃糖基側(cè)鏈嚴重抑制了木聚糖水解酶的活性，因此阻礙了多聚物完全水解為其基本木糖單元（Shallom et al， 2002）。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶是外切型酶，其水解來自含有阿拉伯糖的多糖的末端非還原殘基，特異地催化各類低聚糖和多糖的非還原末端的α-L-1，2-，α-L-1，3-和α-L-1，5-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解，同其他半纖維素水解酶協(xié)同作用能夠促進這些酶的水解活力。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶是木聚糖水解酶系統(tǒng)中不可缺少的一部分，代表了木聚糖水解進程中潛在的限速酶（Saha & Bothast， 1999）。基于氨基酸序列，基本結(jié)構(gòu)相似性和疏水性將α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶分類為5個水解酶家族（GHs），即GH3、GH43、GH51、GH54和GH62 （Henrissat & Davies， 2000）。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶可同其他半纖維素酶協(xié)同作用，使半纖維素得到充分水解（de Vries et al， 2000）。將青霉菌ATCC 62998編碼的內(nèi)切木聚糖酶基因XynC和黑曲霉ATCC 1015編碼的阿拉伯呋喃糖苷酶基因AbfB在構(gòu)巢曲霉A773中重組表達后協(xié)同水解甘蔗渣漿，與XynC單獨作用相比，加入AbfB后水解產(chǎn)物中還原糖含量提高了54%～85%（Goncalves et al， 2012）。從嗜熱特異腐質(zhì)霉Y1 （Yang et al， 2015）分離到的一種α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶協(xié)同作用，兩種酶同時加入和先加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶后加木聚糖酶，從樺木木聚糖中產(chǎn)生的還原糖含量分別為木聚糖酶單獨作用的1.01和1.20倍。來源于鏈霉菌屬PC22 （Raweesri et al， 2008）的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和兩種主鏈水解酶（木聚糖酶和β-木糖苷酶）協(xié)同水解燕麥木聚糖，與兩種主鏈水解酶單獨作用相比，加入α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶后還原糖含量增加了17%。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在增加這些半纖維素的還原糖釋放量中起重要作用，其協(xié)同作用增加了小分子量木寡糖的產(chǎn)量。將α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶聯(lián)合降解木聚糖，能使木聚糖更加充分水解，產(chǎn)生更多木寡糖和單糖。

本研究將從短小芽孢桿菌克隆到的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43在E. coli BL21（DE3）原核表達系統(tǒng)中重組表達，得到分子量為71 kDa的重組蛋白，分析了重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43的酶學(xué)性質(zhì)。將重組Xyn43酶和商業(yè)木聚糖酶聯(lián)合水解燕麥木聚糖，將兩種酶單獨，按先后順序及同時加入。不僅比較了水解產(chǎn)物中還原糖的含量，同時分析了阿拉伯糖和木糖的含量變化。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株與質(zhì)粒：大腸桿菌E.coli BL21（DE3）和質(zhì)粒pET-32a（+）為本實驗室保存。主要試劑：D-木糖，L-阿拉伯糖，和燕麥木聚糖購自BIOMED公司；棒曲酶（Aspergillve clavatus）的突變菌株商業(yè)木聚糖酶，購自上?？颠_食品；其他生化試劑為國產(chǎn)分析純，購自成都科龍化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 xyn43的克隆和重組表達 本實驗室已克隆到xyn43基因，但未能在大腸桿菌E.coli BL21 （DE3）中成功表達。氨基酸序列分析結(jié)果表明該蛋白可跨細胞膜運輸至胞外，屬于胞外蛋白。故在未去除信號肽的情況下，重組蛋白被分泌至胞外，故未見目的條帶表達。因此本研究根據(jù)實驗室已構(gòu)建的工程菌質(zhì)粒為模板分別設(shè)計帶有BamH I和Xho I的設(shè)計去除信號肽的PCR擴增引物：xyn43-PF（CGGATCCGCAAGCACAACAATTGC）和xyn43-PR（CCGCTCGAGTTACCTTTGAGTAAACTGCC）。以克隆到的未去信號肽的xyn43質(zhì)粒DNA為模板，利用引物xyn43-PF和xyn43-PR擴增xyn43的基因序列。PCR擴增產(chǎn)物膠回收后，使用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I分別對xyn43基因和pET32a質(zhì)粒DNA進行雙酶切。將雙酶切過后的xyn43目的基因片段和pET32a載體片段用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒xyn43-pET-32a。然后將重組表達質(zhì)粒xyn43-pET-32a轉(zhuǎn)入大腸桿菌E. coli BL21 （DE3）中進行xyn43的重組表達。

1.2.2 重組蛋白Xyn43的純化 將重組菌體接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中活化菌株，然后轉(zhuǎn)接到新的含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，待菌體生長至OD600為0.6～0.8之間時，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG于16 ℃下誘導(dǎo)16 h表達重組蛋白，離心收集菌體，用PBS緩沖液重懸后超聲破碎，4 ℃，12 000 r·min-1，離心20 min。將上清即粗酶液進行蛋白純化，通過鎳柱進行親和層析。采用連續(xù)洗脫的方式將不同咪唑濃度的緩沖液混合洗柱，收集洗脫蛋白，SDS-PAGE檢測洗脫蛋白的純度。

1.2.3 Xyn43酶活力的測定 以燕麥木聚糖為底物，反應(yīng)體系為1 mL，其中含500 μL 1%（w/v）燕麥木聚糖和用pH 6.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液適當稀釋的酶液，50 ℃反應(yīng)10 min后，加入1 mL DNS終止反應(yīng)，測定540 nm下的吸光值。以每分鐘水解木聚糖產(chǎn)生的相當于1 μmol D-木糖的還原糖所需要的酶量定義為1個酶活力單位（IU）。

1.2.4 Xyn43酶學(xué)性質(zhì)研究 pH對酶活力的影響：分別配制含1%燕麥木聚糖的pH 3.0～10.0的緩沖液：100 mmol·L-1檸檬酸-Na2HPO4 緩沖液（pH 3.0～7.0），50 mmol·L-1 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 8.0），50 mmol·L-1甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9.0～10.0）。在50 ℃條件下水浴反應(yīng)10 min測定酶活力，其中酶活力最高的設(shè)為100%。

溫度對酶活力的影響：用最適pH緩沖液將酶液適當稀釋，分別在30、40、50、60、70、80 ℃的溫度下測定酶活力，反應(yīng)10 min，其中酶活力最高的設(shè)為100%。

pH穩(wěn)定性分析：取適量酶液分別放置于pH 3.0～10.0的緩沖液中，37 ℃水浴放置1 h，于最佳反應(yīng)條件下水浴10 min測定剩余酶活力，其中最高酶活力設(shè)為100%。

熱穩(wěn)定性分析：將適量的酶液分別放置在45、50和55 ℃恒溫水浴下1 h，每間隔10 min取樣一次，然后于最適溫度和最適pH條件下反應(yīng)10 min測定剩余酶活力，將保溫0 min時的初始酶活力設(shè)為100%。

1.2.5 Xyn43與商業(yè)木聚糖酶的協(xié)同作用 以1%（w/v）燕麥木聚糖為底物，首先分別用重組Xyn43酶（3.6 μg·μL-1）單獨水解6 h；木聚糖酶（0.7 μg·μL-1）單獨水解6 h； 重組Xyn43酶和木聚糖酶共同水解6 h。然后， 先加木聚糖酶水解6 h后煮沸冷卻后，再加重組Xyn43酶繼續(xù)反應(yīng)6 h；先加重組Xyn43酶水解6 h后煮沸冷卻后，再加木聚糖酶繼續(xù)反應(yīng)6 h，反應(yīng)溫度為37 ℃。最后，將反應(yīng)液煮沸離心收集上清，用DNS法測定還原糖含量，并用高效液相色譜法分析水解產(chǎn)物中阿拉伯糖和木糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 xyn43的克隆和表達純化

根據(jù)設(shè)計的引物進行基因序列擴增得到PCR擴增產(chǎn)物（圖1：A），該基因全長1 458 bp，編碼485個氨基酸，預(yù)測的蛋白分子量為71 kDa。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒xyn43-pET-32a轉(zhuǎn)入大腸桿菌E. coli BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達，通過鎳柱進行親和層析分離純化蛋白，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，重組Xyn43蛋白分子量與預(yù)測的蛋白大小基本一致（圖1：B）。

2.2 Xyn43的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 Xyn43的最適pH和溫度 在pH3.0～10.0的緩沖液中測定Xyn43的酶活力，圖2結(jié)果表明，Xyn43的最適pH為6.0，在pH6.0～8.0之間能保持在80%以上的相對酶活力，當緩沖液pH小于5.0或大于9.0時該酶的相對酶活低于50%。在30～80 ℃溫度范圍內(nèi)測定Xyn43的酶活力，圖3結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，溫度在30～40 ℃時相對酶活保持在75%以上，當反應(yīng)溫度為60 ℃時該酶的相對酶活約為55%，溫度高于70 ℃時，相對酶活降低到30%以下。

2.2.2 Xyn43的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性 取適量酶液分別放置于pH3.0～10.0的緩沖液中，37 ℃水浴放置1 h，于最適反應(yīng)條件下測定剩余酶活力，其中酶活力最高的設(shè)為100%。圖4結(jié)果表明，重組Xyn43酶在pH8.0的緩沖液中穩(wěn)定性最好，在pH5.0～10.0之間較穩(wěn)定且相對酶活保持在70%以上，在pH3.0～4.0酸性條件下放置1 h后相對酶活力殘留30%以下。

將適量酶液分別在45、50、55 ℃溫度下恒溫水浴1 h，每間隔10 min取酶液于最適反應(yīng)條件下測定剩余酶活力，將保溫0 min時的酶活力設(shè)為100%。圖5結(jié)果表明，該酶在45、50、55 ℃條件下比較穩(wěn)定，其中45 ℃時最穩(wěn)定，1 h后酶活力仍能保留為75%左右，50 ℃和55 ℃為其次，1 h后分別能殘留65%和68%左右的酶活力。

2.3 Xyn43與商業(yè)木聚糖酶協(xié)同水解燕麥木聚糖

將重組Xyn43酶與來源于棒曲霉突變菌株的商業(yè)木聚糖酶協(xié)同水解燕麥木聚糖，以1%（w/v）燕麥木聚糖為底物，將重組Xyn43酶和木聚糖酶同時、先后或單獨加入反應(yīng)體系中，通過DNS法測定水解產(chǎn)物中還原糖的含量，并用高效液相色譜法對水解產(chǎn)物中阿拉伯糖和木糖含量進行分析。由表1可知，當重組Xyn43酶和木聚糖酶同時加入，先加木聚糖酶后加重組Xyn43酶，先加重組Xyn43酶后加木聚糖酶產(chǎn)生的還原糖含量分別為木聚糖酶單獨作用的1.16，1.20和0.92倍。由表2可知，相較于木聚糖酶單獨作用，兩種酶同時作用或先加木聚糖酶后加Xyn43酶，木糖含量分別增加了35%和48%，而先加重組Xyn43酶后加木聚糖酶產(chǎn)生的木糖含量為木聚糖酶單獨作用的88%。與先加重組Xyn43酶后加木聚糖酶相比，兩種酶同時加入和先加木聚糖酶后加重組Xyn43酶產(chǎn)生的阿拉伯糖含量分別提高了72%和94%。

3 討論與結(jié)論

半纖維素作為一種豐富的可再生資源，其產(chǎn)物可作為飼料和生物能源，國內(nèi)外對木質(zhì)纖維素的開發(fā)利用越來越重視和廣泛關(guān)注。通過生物技術(shù)法將這些低成本的生物質(zhì)轉(zhuǎn)變成有價值的產(chǎn)品，如乙醇和工業(yè)化學(xué)品，對于生態(tài)環(huán)保來說是必不可少的。半纖維素是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多取代的高度分枝的異質(zhì)多糖， 其生物降解需要一個酶系統(tǒng)參與完成，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶是參與酶水解L-阿拉伯糖鏈的酶，能有效水解果膠、半纖維素殘留的多糖（阿拉伯聚糖，脫支阿拉伯聚糖）、阿拉伯糖半乳聚糖和阿拉伯木聚糖等，在降解半纖維素的過程中，能促進其他半纖維素酶的水解，提高水解效率。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶作為主要的木聚糖側(cè)鏈水解酶，在工業(yè)生產(chǎn)上被廣泛應(yīng)用（Saha， 2000； Numan & Bhosle， 2006），包括釀酒、面包工藝、果汁處理、生物乙醇、保健藥品的生產(chǎn)等。

本研究將從短小芽孢桿菌中克隆到的編碼α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43在E. coli BL21中成功表達，構(gòu)建了工程菌xyn43-pET32a高產(chǎn)菌株。該酶是一種單一的阿拉伯呋喃糖苷酶，具有較好的溫度穩(wěn)定性和廣泛的pH耐受性。將Xyn43酶與來源于棒曲霉突變菌株的商業(yè)木聚糖酶協(xié)同水解燕麥木聚糖，結(jié)果表明兩種酶同時作用和先加木聚糖酶后加Xyn43酶，水解產(chǎn)物的還原糖含量，木糖和阿拉伯糖含量都有明顯提高，水解效率高于木聚糖酶單獨作用，但先加入Xyn43酶后加入木聚糖酶產(chǎn)生的還原糖，阿拉伯糖和木糖含量反而低于木聚糖酶單獨作用。這一現(xiàn)象在之前的研究中也被報道過，如從嗜熱特異腐質(zhì)霉Y1（Yang et al， 2015）分離到的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶協(xié)同作用，按先木聚糖酶后α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的順序水解樺木木聚糖，產(chǎn)生的還原糖含量為木聚糖酶單獨作用的98%。這可能是因為先加入Xyn43酶，產(chǎn)生了少量的阿拉伯糖，從而抑制了木聚糖酶的酶活力，也可能是因為Xyn43酶結(jié)合在了木聚糖酶的底物結(jié)合位點，導(dǎo)致木聚糖酶與底物的結(jié)合能力降低，這與底物的結(jié)構(gòu)和酶的作用機制等相關(guān)，具體原因還需后續(xù)對酶的作用機制進一步研究來探討。本研究的水解產(chǎn)物中含有木寡糖，阿拉伯糖和木糖，木聚糖酶單獨作用時只能產(chǎn)生木寡糖和少量的木糖，不能生成阿拉伯糖，在木聚糖酶中加入Xyn43酶后，不僅生成了阿拉伯糖，木糖的產(chǎn)量也有提高。其中先加木聚糖酶后加Xyn43酶產(chǎn)生的木糖和阿拉伯糖含量最高，同時發(fā)現(xiàn)當先加木聚糖酶后加Xyn43酶或者兩種酶同時作用時木寡糖峰與其他酶組合相比會有明顯的下降，而阿拉伯糖峰則會相應(yīng)的升高，產(chǎn)生的阿拉伯糖含量更多。這可能是因為當木聚糖酶先作用時，產(chǎn)生了大量的木寡糖，Xyn43酶能從這些木寡糖的側(cè)鏈中水解產(chǎn)生阿拉伯糖。這表明Xyn43酶不僅能從燕麥木聚糖這樣的多聚糖的側(cè)鏈水解釋放阿拉伯糖，也能水解木寡糖側(cè)鏈的一些阿拉伯糖殘基，產(chǎn)生阿拉伯糖。

目前，商業(yè)半纖維素酶制劑需要富集幾種輔助酶，包括阿拉伯呋喃糖苷酶以有效地將半纖維素轉(zhuǎn)化為單糖，但稀酸預(yù)處理后會抑制隨后的微生物發(fā)酵副產(chǎn)物的生產(chǎn)。在堿性條件下處理不僅避免了酸處理帶來的環(huán)境污染，也能夠減少對微生物發(fā)酵的抑制。本研究中的重組阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43是一種強耐堿性酶，且能顯著促進木聚糖的酶活力，提高水解效率，因此可作為商業(yè)半纖維素酶的輔助酶，用于生物質(zhì)資源的生物轉(zhuǎn)化。

此外，L-阿拉伯糖苷殘基廣泛分布于半纖維素的側(cè)鏈中。L-阿拉伯糖是一種帶有甜味的不易被人體吸收的攝取量低的單糖，可作為可能的食品添加劑（Matsuo et al， 2000）。同時L-阿拉伯糖能選擇性地競爭性抑制腸蔗糖酶，在動物攝取蔗糖后能夠降低血糖反應(yīng)（Seri et al， 1996）。這些研究表明L-阿拉伯糖可作為一種生理功能的糖用于抑制蔗糖消化，用來防止糖尿病人餐后高血糖。本研究中的Xyn43能夠從燕麥木聚糖和木寡糖的側(cè)鏈水解釋放阿拉伯糖，不參與水解燕麥木聚糖主鏈，沒有木聚糖酶活力。因此Xyn43可以參與含有阿拉伯糖苷的多聚糖和木寡糖的水解，生成阿拉伯糖，同時提高木寡糖和木糖的產(chǎn)量。其中木寡糖可作為益生元，木糖能夠用于乙醇發(fā)酵。由此可見Xyn43在阿拉伯糖的生產(chǎn)和半纖維素等多聚糖的生物降解過程中發(fā)揮著重要的作用，對半纖維素等生物質(zhì)的有效利用及生物轉(zhuǎn)化具有重要的參考價值，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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