童愛(ài)均 黃梓芮 洪家麗 呂旭聰 劉斌

摘 要：以果糖添加量、氯化銨和初始含水量為自變量，以紅曲霉總色價(jià)為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)紅曲產(chǎn)色素的固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明：最優(yōu)培養(yǎng)基條件為果糖添加量0.54%、氯化銨添加量0.06%和初始含水量46.00%，該設(shè)計(jì)中模型預(yù)測(cè)的色素最大值為6693.99 U·g-1。進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)測(cè)定實(shí)際所得紅曲色素為6684.16 U·g-1，與模型中預(yù)測(cè)的色素最大值相差不大，說(shuō)明模型設(shè)計(jì)合理，吻合度較高。

關(guān)鍵詞：紅曲色素；固態(tài)發(fā)酵；培養(yǎng)基優(yōu)化；響應(yīng)面試驗(yàn)

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.05.008

Abstract： The solid fermentation conditions of red yeast for pigment production were optimized by using the response surface optimization method in which fructose additive amount， ammonium chloride amount and initial water contents as independent variables and total pigment value as response ones. The results showed that the optimal medium conditions were with 0.54% fructose， 0.06% ammonium chloride， and 46.00% initial water content. The predicted maximum pigment content in this design was 6693.99 U·g-1. Repeated verification tests were conducted， and the actual pigment production reached 6684.16 U·g-1， which was with little difference with the predicted maximum pigment output in the model， indicating that the model was well-designed with a high degree of coincidence.

Key words： Monascus pigment； solid fermentation； medium optimization； response surface test

紅曲，是紅曲菌（Monascus）的發(fā)酵產(chǎn)品，在我國(guó)的福建、浙江、江西、廣東、臺(tái)灣一帶廣為使用[1]。紅曲色素是紅曲的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是天然色素中穩(wěn)定性最佳的色素[2-4]，作為一種藥食兩用的天然色素其應(yīng)用前景非常廣闊。近年來(lái)，由于亞硝酸鹽的安全性問(wèn)題紅曲色素逐漸替代亞硝酸鹽作為內(nèi)制品著色劑[5-6]。

在固態(tài)發(fā)酵中，紅曲色素受固體基質(zhì)、外加碳源、外加氮源、無(wú)機(jī)鹽、初始含水量等多種因素的影響，總色價(jià)普遍偏低，制約了紅曲色素大規(guī)模規(guī)范化工業(yè)生產(chǎn)[7-9]。提高紅曲色素產(chǎn)量包括菌種誘變、固定化細(xì)胞技術(shù)、菌種聯(lián)合培養(yǎng)、超聲波處理與優(yōu)化培養(yǎng)基等多種途徑[10]。如何優(yōu)化固體發(fā)酵培養(yǎng)基、提升發(fā)酵水平、提高色素產(chǎn)量等技術(shù)問(wèn)題，已經(jīng)倍受國(guó)內(nèi)外相關(guān)科研機(jī)構(gòu)關(guān)注與研究[11-12]。本研究采用響應(yīng)面分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)室篩選培育的紅曲色素高產(chǎn)菌株進(jìn)行固體發(fā)酵的培養(yǎng)基優(yōu)化，旨在提高紅曲色素產(chǎn)量，為大規(guī)模規(guī)范化工業(yè)生產(chǎn)做好理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 紅曲霉M3：由本試驗(yàn)室篩選保存。

1.1.2 主要儀器 UV2601型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北分瑞利公司有限公司；ME204E分析天平：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；LRH生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器公司；OKS24電熱恒溫水浴鍋：上海精宏公司；VD850型潔凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備公司等。

1.1.3 主要試劑 孢子洗脫液：含0.9% NaCl溶液；70%乙醇：70 mL乙醇用超純水定容到100 mL；拌料液：用乳酸調(diào)得pH=5的超純水；果糖、氯化銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀等均為國(guó)產(chǎn)試劑分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

1.1.4.1 斜面培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：稱取300 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛（煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可），用4層紗布過(guò)濾，再加葡萄糖和瓊脂各20 g，繼續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1000 mL，分裝試管，加塞、包扎，（121℃）滅菌20 min后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4.2 固體發(fā)酵培養(yǎng)基 紅米20 g、KH2PO4 0.20%、MgSO4 0.30%與果糖（0.4%、0.6%、0.8%）、氯化銨（0.03%、0.07%、0.11%）分別裝入250 mL三角瓶中，乳酸調(diào)得pH=5的超純水（40%、50%、60%），浸泡12 h后包扎，121℃滅菌30 min，稍冷卻后搖散，接種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 試管斜面培養(yǎng)：試管斜面接種后在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，至菌絲長(zhǎng)滿斜面。茄子瓶斜面培養(yǎng)：茄子瓶斜面接種后在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，至菌絲長(zhǎng)滿斜面。紅曲色素固體發(fā)酵培養(yǎng)：接種5 mL于裝有基質(zhì)的250 mL三角瓶中，于30℃條件下避光培養(yǎng)10 d。

1.2.2 發(fā)酵物色價(jià)的測(cè)定 取發(fā)酵物約0.5 g，用70%乙醇10 mL浸泡振蕩，超聲波10 min過(guò)濾，取濾液適當(dāng)稀釋后在410、465、510 nm下測(cè)吸光度值分別為黃、橙、紅色價(jià)。總色價(jià)=（OD410+OD465+OD510）×稀釋倍數(shù)[13]。

1.2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)Box-Benhnken 的原理，建立中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)學(xué)模型，采用Desin-Expert.8.05b版本中的Central Composite Design設(shè)計(jì)法以果糖添加量（A）、氯化銨添加量（B）和初始含水量（C）3個(gè)因子為自變量，紅曲總色價(jià)產(chǎn)值（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因子3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。Central Composite Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平列于表1。用Desin-Expert.8.05b軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理和方差分析，根據(jù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到響應(yīng)變量（果糖添加量、氯化銨添加量和初始含水量）與響應(yīng)值（色價(jià)）之間的多元二次回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型方程的建立

響應(yīng)變量（果糖添加量、 氯化銨添加量和初始含水量）與響應(yīng)值（色價(jià)）之間的多元二次回歸方程。

2.2 回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)表2的數(shù)據(jù)，對(duì)M3紅曲霉總色價(jià)的回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果列于表3。該回歸模型極顯著（P<0.0001）?；貧w模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9943，校正系數(shù)R2Adj=0.9891，變異系數(shù)為7.43%，表明模型的擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小。失擬項(xiàng)P值為0.599 6，提示其影響不顯著，即失擬項(xiàng)與純誤差之間差異不顯著。該模型擬合較好，線性關(guān)系顯著，可以用于后續(xù)的理論推測(cè)，可以對(duì)紅曲固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)。對(duì)回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，果糖添加量A及其二次項(xiàng)A2，氯化銨添加量B及其二次項(xiàng)B2，初始含水量C及其二次項(xiàng)C2對(duì)總色價(jià)有著極顯著（P<0.01）的影響；設(shè)計(jì)中果糖與其他2個(gè)因素之間交互作用不顯著（P>0.05）3個(gè)因素對(duì)紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素能力的影響強(qiáng)度順序依次為初始含水量>氯化銨添加量>果糖添加量。

2.3 雙因子效應(yīng)分析

雙因子效應(yīng)分析見(jiàn)圖1a、圖1b，圖2a、圖2b，圖3a、圖2b。對(duì)二次回歸方程求解，可得出3個(gè)因素果糖添加量、氯化銨添加量和初始含水量的最佳水平，此時(shí)可得3個(gè)因素的真實(shí)值，A=0.54、B=0.06、C=46.00。即最優(yōu)培養(yǎng)基條件：果糖添加量為0.54%、氯化銨添加量為0.06%和初始含水量46.00%，該設(shè)計(jì)中模型預(yù)測(cè)的色素最大值為6693.99 U·g-1。

為驗(yàn)證該模型，采用模型中的最佳發(fā)酵條件：果糖添加量為0.54%、氯化銨添加量0.06%、初始含水量46.00%、0.30% KH2PO4、0.20% MgSO4、初始pH 5.0、培養(yǎng)溫度30℃

、裝米量20 g、接種量5 mL。按照以上條件進(jìn)行了5次重復(fù)紅曲菌發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)，經(jīng)測(cè)定實(shí)際所得紅曲色素為6684.16 U·g-1，與模型中預(yù)測(cè)的色素最大值相差不大，說(shuō)明模型設(shè)計(jì)合理，吻合度較高。

3 結(jié)論

利用模型的響應(yīng)面對(duì)二次回歸方程求解，可得出果糖添加量、氯化銨添加量和初始含水量的最佳水平，即最優(yōu)培養(yǎng)基條件：果糖添加量3個(gè)因素0.54%、氯化銨添加量0.06%和初始含水量46.00%，該設(shè)計(jì)中模型預(yù)測(cè)的色素最大值為6693.99 U·g-1。果糖添加量為0.54%、氯化銨添加量0.06%、初始含水量3個(gè)因素46.00%、KH2PO40.30% 、MgSO40.20% 、初始pH 5.0、培養(yǎng)溫度30℃、裝米量20 g、接種量5 mL。按照以上條件進(jìn)行了5次重復(fù)紅曲菌發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)，經(jīng)測(cè)定實(shí)際所得紅曲色素為6684.16 U·g-1，與模型中預(yù)測(cè)的色素最大值相差不大，說(shuō)明模型設(shè)計(jì)合理，吻合度較高。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）