李琦

文章編號(hào)： 1005-2690（2018）07-0082-02 中圖分類號(hào)： Q943 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

摘 要：植物原生質(zhì)體融合技術(shù)可打破物種生殖隔離障礙，實(shí)現(xiàn)基因在物種間的轉(zhuǎn)移和遺傳重組，創(chuàng)造出具有親本優(yōu)良性狀的遠(yuǎn)緣雜交物種。對(duì)于植物原生質(zhì)體融合來說，PEG-高Ca2+-高pH融合法可使原生質(zhì)體達(dá)到理想的融合效果，對(duì)植物培養(yǎng)有重要意義。主要介紹了PEG-高Ca2+-高pH融合法，為植物原生質(zhì)體融合的研究發(fā)展提供基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞：原生質(zhì)體；PEG-高Ca2+-高pH融合法；研究

在培養(yǎng)物中加入聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）可促使植物原生質(zhì)體融合，而原生質(zhì)體處于高pH高Ca2+的條件下也能促使原生質(zhì)體融合。后來凱勒（Keller）發(fā)現(xiàn)了PEG-高Ca2+-高pH融合法。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PEG-高Ca2+-高pH融合法促進(jìn)原生質(zhì)體融合的效率較PEG融合法更加理想。

1 PEG-高Ca2+-高pH融合法的研究發(fā)現(xiàn)

1973年，Keller[1]在誘導(dǎo)煙草原生質(zhì)體時(shí)發(fā)現(xiàn)，原生質(zhì)體在高pH高Ca2+的條件下可發(fā)生融合。在多數(shù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用這一融合方法可使20%～50%的原生質(zhì)體發(fā)生融合。1974年，Keller等發(fā)現(xiàn)，用含有高濃度Ca2+（7.35 g/L CaCl2·2H20）的強(qiáng)堿性溶液（pH值為9～10）清洗PEG時(shí)，原生質(zhì)體融合的效果要比用培養(yǎng)基清洗高很多，因此將PEG融合法與高pH高Ca2+法結(jié)合在一起，建立了PEG-高Ca2+-高pH融合法。

該法的主要操作步驟是：用適當(dāng)?shù)谋壤龑煞N不同的原生質(zhì)體進(jìn)行混合，使其形成小滴狀，在小滴狀的原生質(zhì)體上及其周圍加上PEG溶液，使原生質(zhì)體粘連融合；用高pH高Ca2+溶液清洗PEG，最后用培養(yǎng)基清洗，去高pH高Ca2+溶液。后來有學(xué)者對(duì)該法進(jìn)行了改良[2]，將原生質(zhì)體懸浮液滴入蓋玻片或離心管中，靜置使其形成薄層原生質(zhì)體后，加入20%～40%的PEG 6 000、40%蔗糖、1.47 g/L CaCl2等融合液處理，經(jīng)離心洗滌后培養(yǎng)，最后在固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。也有學(xué)者[3]或?qū)︹}溶液進(jìn)行替換，或?qū)EG進(jìn)行改良，或?qū)Σ僮鞑襟E進(jìn)行改進(jìn)，都獲得了融合原生質(zhì)體。

2 PEG-高Ca2+-高pH融合法的作用機(jī)理

PEG是一種高分子化合物，含有醚鍵而具有負(fù)極性，可與蛋白質(zhì)、水、碳水化合物等一些正極化基團(tuán)形成氫鍵，PEG帶有大量的負(fù)電荷，也可與水之間形成氫鍵。因此，PEG與水、蛋白質(zhì)、碳水化合物之間的氫鍵相結(jié)合，使溶液中自由水消失，植物細(xì)胞由于高度脫水使原生質(zhì)體發(fā)生凝集，形成大小不一的凝集物，促進(jìn)原生質(zhì)體連接更加緊密。當(dāng)PEG分子足夠長(zhǎng)時(shí)，可作為鄰近原生質(zhì)體表面之間的分子橋而使之粘連。同時(shí)由于PEG的負(fù)極性，能夠結(jié)合Ca2+與原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷形成靜電鍵，加強(qiáng)原生質(zhì)體粘連和結(jié)合。

洗滌的過程中，連接在原生質(zhì)體膜上的PEG分子可被洗脫下來，引起電荷的紊亂和再分布，也可能是被剝?nèi)サ鞍踪|(zhì)相鄰細(xì)胞膜類脂質(zhì)間的反應(yīng)，產(chǎn)生了變化與重排，導(dǎo)致細(xì)胞膜局部融合，形成小的細(xì)胞質(zhì)橋，進(jìn)而發(fā)生兩個(gè)原生質(zhì)體的融合。高Ca2+與高pH環(huán)境的存在，加劇了電荷的不穩(wěn)定性，促使重排的快速進(jìn)行，增加了質(zhì)膜的流動(dòng)性，提高了融合效率。沖洗時(shí)產(chǎn)生的滲透和碰撞沖擊，也有可能促進(jìn)融合的發(fā)生。但需要注意的是，PEG對(duì)細(xì)胞有一定的毒性作用，其相對(duì)分子質(zhì)量越大，毒性越強(qiáng)。

3 影響PEG-高Ca2+-高pH融合法的因素

3.1 PEG的相對(duì)分子質(zhì)量

一般所用的PEG相對(duì)分子質(zhì)量為1 000～6 000，PEG分子量大于1 000時(shí)，才能誘導(dǎo)原生質(zhì)體達(dá)到緊密的粘連和較為理想的融合效果，不同種類的原生質(zhì)體對(duì)PEG分子量的要求不同。

3.2 PEG的濃度及處理時(shí)間

PEG的濃度較低或處理時(shí)間過短，會(huì)導(dǎo)致融合效果不理想；濃度過高或處理時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)造成PEG對(duì)原生質(zhì)體的毒害作用增強(qiáng)，可能造成原生質(zhì)體的活性喪失，或減少異核體的融合率。

3.3 原生質(zhì)體的生理狀況和密度

應(yīng)選擇生理活性較高的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，原生質(zhì)體密度過高或過低都不利于原生質(zhì)體的融合。密度低，融合效率較低；密度高，則會(huì)出現(xiàn)多重融合現(xiàn)象，導(dǎo)致雙核異質(zhì)體含量減少，達(dá)不到預(yù)期的試驗(yàn)和生產(chǎn)效果。一般原生質(zhì)體的濃度要達(dá)到106～108個(gè)/mL。

3.4 原生質(zhì)體的選擇及材料的預(yù)處理

沈前華等研究證明，雙子葉植物的葉片是原生質(zhì)體的最佳材料，另外，愈傷組織、外植體和細(xì)胞懸浮物也常是原生質(zhì)體的培養(yǎng)材料。有試驗(yàn)表明，對(duì)植物材料預(yù)處理后的原生質(zhì)體分離效率更高，且兩種原生質(zhì)體的外觀最好選用易于區(qū)分的。

3.5 溫度

適當(dāng)?shù)母邷啬芴岣呷诤闲剩话阍?0～30 ℃條

件下處理1～10 min。有試驗(yàn)證明，在35～37 ℃條件下，特別有利于高度液泡化的原生質(zhì)體融合。

3.6 PEG的清洗

應(yīng)按一定的步驟進(jìn)行，切勿劇烈清洗，易使異核體數(shù)目減少，原生質(zhì)體遭到物理性破壞。

3.7 選擇配制合適的培養(yǎng)基

培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物的含量、pH值、滲透壓、激素的種類和比例等都根據(jù)不同植物原生質(zhì)體的種類不同而有一定的差異。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] Keller W A & Melchers G.Effect of high pH and calcium on

tobacco leaf protoplast fusion[J]. Z.Nalurforsch.C，1973（28）：

737-741.

[ 2 ] 鞏振輝，申書興.植物組織培養(yǎng)[M].北京：

化學(xué)工業(yè)出版社，2013.

[ 3 ] 黃國(guó)文.野燕麥原生質(zhì)體制備和融合的

研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（23）：

9 546-9 547.

（收稿日期：2018-06-08）