劉佳 吳能表

摘 要：為了研究不同濃度AgNO3對顛茄毛狀根生長過程中托品烷類生物堿及影響其合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響，該研究使用五種不同濃度的AgNO3處理黑暗培養(yǎng)12 d的顛茄毛狀根，2 d后收集毛狀根并測定其鮮、干質(zhì)量、托品烷類生物堿的含量、部分生理指標(biāo)（MDA、Pro、可溶性糖、可溶性蛋白）、關(guān)鍵酶基因（pmt、trI、h6h）表達(dá)量。結(jié)果表明：AgNO3雖然抑制了顛茄毛狀根的生長，但卻促進(jìn)了托品烷類生物堿的積累，與對照相比，50、100、150 μmol·L1處理均顯著性地提高了托品烷類生物堿的產(chǎn)量。同時(shí)在150 μmol·L1處理下，毛狀根代謝途徑中MDA與對照相比均具有顯著性的提高，脯氨酸含量在150 μmol·L1下也有了顯著性提高，達(dá)到了5.92 μg·g1FM，是對照的2.91倍?？扇苄蕴桥c可溶性蛋白含量在150 μmol·L1濃度下處理時(shí)其含量分別是對照的1.55倍和1.67倍。托品烷類生物堿合成過程中關(guān)鍵酶基因（pmt、trI、h6h）的表達(dá)量在不同濃度AgNO3處理下均有不同程度的提高。由此可以推斷，AgNO3在150 μmol·L1處理下，可能通過調(diào)控脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖這幾種初級(jí)代謝產(chǎn)物或某幾種關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來影響顛茄毛狀根托品烷類的合成。

關(guān)鍵詞：顛茄，硝酸銀，托品烷類生物堿，毛狀根，基因表達(dá)量

中圖分類號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：10003142（2018）06078107

Abstract：In this study，we studied the influences of different concentrations of AgNO3 on tropane alkaloids and key enzyme genes in metabolic pathway. We all know that the accumulation of plant secondary metabolites is directly related to some tprimary metabolism and activity of key enzymes. And AgNO3 is a heavy metal，which can induce oxidative stress in plants and which has a great effect on plant growth and key enzymes of metabolism. Therefore，we added five concentrations of AgNO3 into Atropa belladonna hairy roots，and cultivated in B5 liquid medium for 12 d，and then，we collected hairy roots and determined fresh weight，dry weight，contents of tropane alkaloids，some physiological indexes included MDA，Pro，soluble sugar and soluble protein，genes expression level after cultivated for 2 d. The results showed that AgNO3 promoted the accumulation of the alkaloids，although AgNO3 inhibited the growth of hairy roots，50，100，150 μmol·L1 AgNO3 could improve the contents of tropane alkaloids compared with control. Meanwhile，150 μmol·L1 treatment group significantly improved the hairy roots of the content of MDA compared with control. As well as the content of Pro increased to 5.92 μg·g1FM，2.91 times of control. Then，the contents of soluble sugar and souble protein were significantly improved 1.55 and 1.67 times of control respectively by treating with 150 μmol·L1 AgNO3 treatment. Thus，with the treatment of AgNO3，gene expressions （pmt，trI，h6h） of key enzymes in the metabolic pathway of A. belladonna hairy roots all increased their produced effects. Therefore，we could be inferred that the contents of tropine alkaloids in A. belladonna hairy roots could regulate and control primary metabolism such as Pro，soluble protein，soluble sugar and secondary metabolism like expressions of key enzyme genes with the treating of AgNO3. This study could provide the basic theories for study the synthesis mechanism of tropane alkaloids and an effective method to enhance the medicinal composition in the culture of hairy roots of Atropa belladonna in the future.

Key words：Atropa belladonna，AgNO3，tropane alkaloids，hairy roots，expression of gene

顛茄（Atropa belladonna），俗名野山茄、顛茄草，茄科顛茄屬多年生草本植物（中國藥典，2015）。顛茄是一種常見且常用的藥用植物，全草可入藥，葉和根含莨菪堿與東莨菪堿，臨床上可制成配劑和浸膏用于麻醉、鎮(zhèn)痛、抗暈動(dòng)癥等（肖培根，2002）。已有研究表明，藥用植物中含有多種有效的活性物質(zhì)，對人類的健康和發(fā)展都有著重要的作用（Verpoorte & Memelink，2002）。然而，隨著市場需求的不斷變化，加之長期不當(dāng)?shù)牟煞ゼ吧鷳B(tài)環(huán)境的破壞，使藥用植物中的活性物質(zhì)含量越來越低，成為藥用植物進(jìn)軍國際市場的一大瓶頸（Namdeo，2007）。

近年來，毛狀根培養(yǎng)技術(shù)已在植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)、品種改良和特種植物栽培等領(lǐng)域有了廣泛且有效的應(yīng)用（Georgiev et al，2007）。在植物生長期間添加誘導(dǎo)子也是提高多種植物次生代謝產(chǎn)物含量的有效途徑。誘導(dǎo)子能夠引起植物體內(nèi)特殊的次生代謝產(chǎn)物的合成，所以誘導(dǎo)子成為一種提高毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的有效方法（Savitha et al，2006）。AgNO3是一種重金屬，可誘導(dǎo)植物體內(nèi)的氧化脅迫，從而對植物的生長及代謝產(chǎn)生較大的影響（Vasconsuelo & Boland，2007）。一般來說，植物次生代謝產(chǎn)物的積累都會(huì)與代謝過程中關(guān)鍵酶的活性有直接或間接的關(guān)系。如黃蕾等（2013）的研究發(fā)現(xiàn)，硝酸鉛可促進(jìn)花楸懸浮細(xì)胞的生長并刺激次生代謝產(chǎn)物的積累。目前對顛茄的研究主要集中在代謝途徑中關(guān)鍵酶基因克隆的研究（強(qiáng)瑋，2012）；通過調(diào)控次生代謝產(chǎn)物中關(guān)鍵酶基因的過量表達(dá)來提高顛茄托品烷類生物堿含量（李金娣等，2013）。這種方法成本較高不利于大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)基因的過表達(dá)可能會(huì)存在嵌合體，導(dǎo)致遺傳的不穩(wěn)定。但目前尚未見通過添加誘導(dǎo)子來研究其對顛茄毛狀根生物堿含量以及代謝過程中關(guān)鍵酶基因影響的相關(guān)報(bào)道。本研究以顛茄毛狀根為材料，通過添加AgNO3探究誘導(dǎo)子對顛茄毛狀根的生長及代謝過程中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響，旨在為提高顛茄藥用成分有效研究提供參考，為顛茄毛狀根的進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)提供了依據(jù)，同時(shí)對顛茄托品烷類生物堿的合成調(diào)控機(jī)理的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

西南大學(xué)三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存在B5培養(yǎng)基上的顛茄毛狀根。

1.2 方法

1.2.1 AgNO3的制備 將AgNO3用蒸餾水溶解定容，配制成100 μmol·L1的母液，過0.22 μm濾膜除菌備用。

1.2.2 誘導(dǎo)子的添加及培養(yǎng) 將0.5 g新鮮顛茄毛狀根接于150 mL 含有B5液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，110 r·min1、恒溫、（25±1） ℃避光培養(yǎng)12 d，將原有培養(yǎng)基倒掉，換成添加不同濃度AgNO3的新鮮液體培養(yǎng)基，使AgNO3終濃度均分別為25、50、100、150、200 μmol·L1。相同條件下培養(yǎng)2 d。

1.2.3 毛狀根鮮、干質(zhì)量的測定方法 收集處理后的毛狀根，用蒸餾水沖洗毛狀根上殘留的液體培養(yǎng)基，濾紙吸干水分后稱重，即為毛狀根的鮮質(zhì)量。將新鮮的毛狀根于60 ℃烘箱中烘干至恒重后稱重，即為毛狀根的干質(zhì)量。

1.2.4 顛茄毛狀根中托品烷類生物堿的提取 參照Zrate et al（1997）的提取方法，略有改動(dòng)：將毛狀根于烘箱中60 ℃烘干至恒重，充分研磨，過50目篩；稱取0.100 0 g加10 mL提取液（CHCl3-MeOH-NH4OH（15∶5∶1）），超聲提取30 min，室溫放置過夜。提取液抽濾，2 mL CHCl3沖洗殘?jiān)喜⑺袨V液；40 ℃真空濃縮至干，殘留物用5 mL CHCl3和2 mL 1 mol·L1 H2SO4溶解，靜置分層，收集硫酸相，濃氨水調(diào)pH至10，再分別加入4 mL CHCl3提取兩次，靜置；分層后取下層于40 ℃真空濃縮，殘留物用1 mL甲醇溶解，即為樣品液。0.22 μm濾膜過濾，-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 色譜條件 色譜柱為Ultimate XBC18色譜柱（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；流動(dòng)相為甲醇∶醋酸銨（pH4.6）=58∶42；流速為1.0 mL·min1；檢測波長為215 nm；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.6 部分生理指標(biāo)測定 脯氨酸、可溶性蛋白含量的測定參照高俊鳳（2006）的方法；MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法（趙世杰等，1991）；可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法（李合生，2000）。

1.2.7 關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的測定 使用Biospin Plant Total RNA Extraction Kit 試劑盒提取總RNA，Promega GoScript試劑盒反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以cDNA為模板，pgk為內(nèi)參基因，使用Promega GoTaq qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)結(jié)束后，分析溶解曲線、擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終得到各基因的表達(dá)量。PCR所用的引物見表1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理和方差分析，Origin 8繪圖。數(shù)據(jù)均以x ± s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 AgNO3對顛茄毛狀根的生長及托品烷類生物堿的影響

從表2可以看出，AgNO3抑制了顛茄毛狀根的生長，毛狀根的鮮質(zhì)量隨試驗(yàn)濃度的增加逐漸降低，濃度大于100 μmol·L1時(shí)抑制作用與對照相比均有了顯著性提高；而干質(zhì)量在各處理組均表現(xiàn)出顯著性地抑制，最高濃度時(shí)抑制效果最明顯，僅為對照的73.64%。雖然AgNO3對顛茄毛狀根的生長產(chǎn)生了抑制作用，但其托品烷類生物堿的含量卻提高了，東莨菪堿的含量在50、100、150 μmol· L1時(shí)與對照相比有了顯著性的增加，100 μmol· L1時(shí)含量達(dá)到了對照的2.5倍，莨菪堿的含量被AgNO3處理后均有顯著性地提高；最終50、100、150 μmol·L1處理組與對照相比依然提高了托品烷類生物堿的產(chǎn)量，且均具有顯著性。

2.2 AgNO3對顛茄毛狀根生長過程中部分生理指標(biāo)的影響

從圖1可以看出，除25 μmol·L1處理外，其余四組處理均顯著地增加了MDA的含量，150 μmol·L1處理效果最為明顯，是對照的1.24倍；其次毛狀根中脯氨酸的含量也因?yàn)锳gNO3的添加全都有了顯著性地提高，150 μmol·L1處理達(dá)到5.92 μg·g1FM，是對照的2.91倍，且與25、50、200 μmol·L1處理具有顯著性差異；各處理組可溶性糖與可溶性蛋白的含量與對照相比也都有了顯著性提高，其中可溶性糖含量在150與200 μmol·L1處理時(shí)其含量分別是對照的1.55、1.52倍，且與25、50 μmol·L1處理具有顯著性差異?？扇苄缘鞍缀吭?0、150 μmol·L1兩組處理中含量的提高均比較明顯，分別達(dá)到了10.228、9.949 mg·g1FM，較對照分別增加了20.08%、16.78%，同時(shí)這兩組處理與25、50 μmol·L1處理具有顯著性差異。

2.3 誘導(dǎo)子對毛狀根托品烷類生物堿關(guān)鍵基因表達(dá)量的影響

從圖2可以看出，五種濃度AgNO3均能顯著刺激pmt基因的表達(dá)，50、100 μmol· L1處理組分別為對照的3.45倍和3.32倍，且與25、200 μmol· L1誘導(dǎo)處理組均存在顯著性差異；其次，除200 μmol· L1處理組外的四種濃度處理均可顯著地刺激trI基因的表達(dá)，50、100 μmol·L1處理與其他三組存在顯著性差異；最后，在h6h基因的表達(dá)中，200 μmol·L1處理組與對照相比沒有顯著性地提高表達(dá)，而其他四組可以顯著性地提高h(yuǎn)6h基因的表達(dá)，100 μmol·L1處理組對該基因的誘導(dǎo)效果最強(qiáng)烈，較對照基因表達(dá)量提高了1.16倍。

3 討論與結(jié)論

AgNO3作為一種非生物誘導(dǎo)子，可誘導(dǎo)植物體內(nèi)的氧化及脅迫，從而對植物的生長及代謝產(chǎn)物產(chǎn)生影響（Vasconsuelo & Boland，2007），因此，近幾年越來越多的被用于植物次生代謝產(chǎn)物含量的提高。本研究發(fā)現(xiàn)：不同濃度的AgNO3均抑制了顛茄毛狀根的生長，這可能是因?yàn)锳gNO3對植物的營養(yǎng)吸收、呼吸作用、光合作用等生物學(xué)進(jìn)程產(chǎn)生了干擾（Clemens，2006）。雖然顛茄毛狀根的生長受到了抑制，但東莨菪堿的含量在50、100、150 μmol· L1時(shí)有了顯著性的增加。這一方面可能是因?yàn)轭嵡衙珷罡谑艿紸gNO3的脅迫后，產(chǎn)生可溶性糖、可溶性蛋白等來預(yù)防這種脅迫，這些初級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生會(huì)使多余的初級(jí)代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成次級(jí)代謝產(chǎn)物，另一方面也有可能是因?yàn)锳gNO3誘導(dǎo)顛茄托品烷類生物堿代謝過程中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，如Xiao & Gao（2010）用Ag+處理丹參毛狀根后，在第6天的mRNA水平上檢測到了PAL轉(zhuǎn)錄達(dá)到最高峰。

誘導(dǎo)子對植物作用的過程中，會(huì)改變植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)從而使細(xì)胞膜發(fā)生氧化，同時(shí)植物會(huì)產(chǎn)生小分子物質(zhì)來增強(qiáng)自身的滲透調(diào)節(jié)能力。MDA是植物細(xì)胞膜氧化的產(chǎn)物，MDA的含量可以作為植物受誘導(dǎo)子脅迫后細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到影響的重要指標(biāo)。脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等是植物體內(nèi)有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)，其累計(jì)可明顯地提高植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，使細(xì)胞在脅迫下保持正常的功能。孫際薇（2014）研究發(fā)現(xiàn)，200 μmol·L1的MJ處理曼陀羅的毛狀根后，導(dǎo)致毛狀根中Pro的含量顯著地高于對照組。本研究同樣也發(fā)現(xiàn)，AgNO3的添加導(dǎo)致毛狀根中MDA、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的提高?？扇苄蕴桥c可溶性蛋白的滲透能力可以防治植物細(xì)胞過度脫水，保持植物細(xì)胞水分的平衡，減少誘導(dǎo)子對植物生長造成的影響（張紅敏，2014）。另外，可溶性蛋白含量的增加，可能是誘導(dǎo)子的添加導(dǎo)致防御蛋白的合成，防御系統(tǒng)啟動(dòng)時(shí)會(huì)有大量的蛋白質(zhì)合成。這些因素都提高了顛茄毛狀根細(xì)胞的調(diào)節(jié)能力，從而對次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累起到良好的作用。

誘導(dǎo)子可作為信號(hào)子被植物細(xì)胞膜上的受體識(shí)別并與其結(jié)合，結(jié)合后可以引起細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，合成與植物次生代謝合成相關(guān)的酶或使其酶的活性發(fā)生變化，從而使植物基因表達(dá)發(fā)生變化，導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物的合成與積累。而且誘導(dǎo)子在與植物相互作用時(shí)能選擇性、快速、高度專一的誘導(dǎo)植物特定基因的表達(dá)，從而積累特定的次生代謝產(chǎn)物（翟俏麗，2011）。Peter & Sang（2003）在罌粟懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的過程中添加真菌誘導(dǎo)子后，誘導(dǎo)子可顯著地誘導(dǎo)了八種生物堿合成基因中的七個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄。在本研究中，25～150 μmol·L1濃度的AgNO3處理均能顯著性地刺激顛茄托品烷類生物堿合成關(guān)鍵基因pmt、trI、h6h的表達(dá)。表明這幾個(gè)基因表達(dá)量的提高均能有效提高顛茄毛狀根中托品烷類生物堿含量的積累。

本研究發(fā)現(xiàn)，添加AgNO3后，顛茄毛狀根的生長受到了抑制，但其托品烷類生物堿的產(chǎn)量在50、100、150 μmol·L1處理時(shí)顯著性地提高了。本研究還發(fā)現(xiàn)，在這三種濃度處理下，顛茄毛狀根生的MDA、脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖的含量與對照相比也有顯著性地提高，同時(shí)顛茄托品烷類生物堿代謝過程中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量也有顯著性地提高。由此可以推測，AgNO3脅迫后，顛茄毛狀根通過脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等生理指標(biāo)影響初級(jí)代謝，從而影響托品烷類生物堿生物堿的積累；同時(shí)從關(guān)鍵酶基因的表達(dá)影響次級(jí)代謝，從而促進(jìn)了托品烷類生物堿的積累。但生理指標(biāo)的改變是否會(huì)影響關(guān)鍵酶的表達(dá)，這個(gè)問題還有待于進(jìn)一步研究。

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