李艷紅 曾衛(wèi)軍 李金玉 葛風(fēng)偉 朱艷蕾 趙惠新

摘 要：AP2/ERF是廣泛存在于植物中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控一些參與非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，幫助植物提高逆境脅迫能力。為了深入探討LaAP2在獨行菜耐受低溫萌發(fā)及幼苗耐受低溫生長中的功能，該研究基于前期對獨行菜（Lepidium apetalum）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫分析，克隆獲得一個顯著上調(diào)表達(dá)的AP2/ERF家族序列LaAP2。該基因cDNA全長為1 005 bp，編碼氨基酸序列包含一個AP2和一個B3結(jié)構(gòu)域，屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子RAV亞家族。推定的LaAP2蛋白分子量為37.744 67 kD ，等電點為9.49。該蛋白氨基酸序列同亞麻薺、擬南芥、油菜等物種顯示出較高同源性，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明與擬南芥親緣關(guān)系較近。氨基酸序列分析預(yù)測表明，LaAP2基因所編碼的蛋白不具備信號肽區(qū)段，無跨膜區(qū)，不屬于分泌蛋白，可能為親水性蛋白；定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性為56.5%，定位于細(xì)胞核的可能性為21.7%；其主要二級結(jié)構(gòu)元件為無規(guī)則卷曲、延伸鏈、α螺旋。Realtime PCR分析獨行菜幼苗中LaAP2在低溫4 ℃處理下的表達(dá)，顯示LaAP2表達(dá)受低溫脅迫呈先下降后升高趨勢。這表明LaAP2在獨行菜幼苗抵抗低溫脅迫中起調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：獨行菜，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，LaAP2基因克隆，序列分析，表達(dá)分析，低溫耐受，分子生物學(xué)

中圖分類號：Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：10003142（2018）06076209

Abstract：AP2/ERF is a kind of important transcription factors widely existing in plants. AP2/ERF regulate the expression of some genes involved in abiotic stress，and help plants improve the ability of adversity stress. We obtained a gene LaAP2 by cloning a significantly upregulated expression AP2/ERF family gene sequence by RTPCR technology，based on the previous analysis of Lepidium apetalum transcriptome database. Bioinformatics analysis of LaAP2 encoded amino acid sequence composition，physical and chemical properties，structure，hydrophobicity，transmembrane region，signal peptide，subcellular localization and secondary protein structure. Realtime PCR was used to detect the expression of LaAP2 gene at 4 ℃ low temperature stress. The result showed that the fulllength cDNA of the gene was 1 005 bp，and the encoded amino acid sequence contains a AP2 and a B3 domain，belonging to the AP2/ERF transcription factor RAV subfamily. The molecular weight of putative LaAP2 protein was 37.744 67 kD and the isoelectric point was 9.49. The amino acid sequence has high homology with Camelina sativa，Arabidopsis thaliana and rape. Phylogenetic analysis showed that the genetic relationship was close to that of A. thaliana. The amino acid sequence analysis showed that LaAP2 gene encoding protein had no signal peptide segments，no transmembrane region，did not belong to the secreted protein. It could be the hydrophilic protein. The possibility of localization in cytoplasm was 56.5%，and in nucleus was 21.7%. The main structural elements were random coil，extending strand and alpha helix. We analyzed the expression of AP2/ERF gene in Lepidium apetalum seedlings under 4 ℃ low temperature stress through Realtime PCR technology，which showed that LaAP2 gene expression was decreased firstly and then increased. The results suggest that LaAP2 play a role in regulating the resistance of low temperature stress in Lepidieae seedling. This study lays the foundation for further study on the function of LaAP2 on the L. apetalum seed germination and seedling growth in tolerance to low temperature.

Key words：Lepidium apetalum，AP2/ERF transcription factor，LaAP2 gene cloning，sequence analysis，expression analysis，low temperature tolerance，molecular biology

獨行菜（Lepidium apetalum）為十字花科獨行菜屬植物，分布非常廣泛。生活在新疆北部的獨行菜能耐受早春低溫進(jìn)行種子萌發(fā)及幼苗的生長，屬典型的早春短命植物（劉彭等，2007）。已有研究發(fā)現(xiàn)，獨行菜幼苗具有很強的低溫耐受能力（趙惠新等，2010；楊娜等，2015），但其耐受低溫進(jìn)行生長的機制目前尚不清楚。轉(zhuǎn)錄因子在植物體生長發(fā)育和植物抵御生物或非生物脅迫過程中起著重要的調(diào)控作用。在不同的脅迫環(huán)境下，激活的轉(zhuǎn)錄因子也不完全相同（Boulikas，1994）。AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子是廣泛存在于植物中的一類轉(zhuǎn)錄因子，在逆境誘導(dǎo)基因的表達(dá)中起著信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用（崔喜艷等，2015）。AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列含有1或2段由60～70個氨基酸殘基組成的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，依據(jù)結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和結(jié)構(gòu)域特點不同分為DREB、ERF、AP2、RAV 4個亞族（Sakuma et al，2002）。DREB亞族和ERF亞族僅含有1個AP2結(jié)構(gòu)域，AP2亞族含有2個AP2結(jié)構(gòu)域，RAV亞族含有1個AP2結(jié)構(gòu)域和1個B3結(jié)構(gòu)域（Nakano et al，2006）。DREB亞族可以調(diào)節(jié)植物抵抗干旱和低溫等非生物逆境（Nakashima et al，2000） ；ERF亞族可以調(diào)節(jié)植物抵抗干旱和高鹽等非生物逆境脅迫（Koussevitzky et al，2007）；AP2亞族在植物生長發(fā)育過程中具有重要作用（ Boutilier et al，2002 ）；RAV亞族在植物抵御生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用（ Sohn et al，2006 ）。

目前，有關(guān)獨行菜AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的研究未見報道。課題組前期對獨行菜種子轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)27條差異基因序列，被注釋為AP2/ERF家族成員基因，相對于萌發(fā)低溫停滯組，在耐受低溫萌發(fā)組的獨行菜種子中，有一個極顯著上調(diào)表達(dá)的AP2/ERF基因序列，命名為LaAP2 （ 周茜等，2016 ）。在已有研究基礎(chǔ)上，本研究采用RTPCR技術(shù)克隆獲得獨行菜LaAP2基因cDNA全長編碼序列，用生物信息學(xué)分析LaAP2編碼的氨基酸序列組成、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、疏水性、跨膜區(qū)、信號肽、亞細(xì)胞定位、二級結(jié)構(gòu)等。熒光定量PCR檢測獨行菜幼苗中LaAP2基因4 ℃低溫脅迫下的表達(dá)。本研究為進(jìn)一步揭示LaAP2轉(zhuǎn)錄因子在獨行菜幼苗耐受低溫中的作用提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

獨行菜種子采自烏魯木齊市鯉魚山，選擇已經(jīng)成熟并且飽滿的種子，室溫干燥后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA全長克隆 獨行菜幼苗生長10 d后，液氮研磨，Trizol法提取總RNA。根據(jù)同源性最高的擬南芥AP2/ERF基因的全長序列，設(shè)計引物，擴增獨行菜LaAP2基因，引物序列如表1所示。

擴增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃，10 min；4 ℃，保存。擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.2 LaAP2序列的生物信息學(xué)分析 測出的DNA序列在NCBI （www.ncbi. nlm.nih.gov BLAST）網(wǎng)站上進(jìn)行分析；利用DNAMAN軟件對測序獲得核苷酸序列進(jìn)行拼接和翻譯成蛋白質(zhì)，并進(jìn)行氨基酸序列的多重比對分析；ORF Finde程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）預(yù)測LaAP2蛋白基因的開放閱讀框；Conserved Domains（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行蛋白質(zhì)保守區(qū)分析； Protscale（http：//web.expasy.org/cgibin/protscale/protscale.pl）分析編碼蛋白的親疏水性；ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析編碼蛋白質(zhì)的相對分子量、等電點、親水性等理化性質(zhì)；TMpred Server（http：//ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）進(jìn)行LaAP2蛋白跨膜區(qū)預(yù)測；Signal P（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）對編碼蛋白信號肽進(jìn)行預(yù)測分析（葛風(fēng)偉等，2016）。PSORT II Prediction（https：//psort.hgc.jp/form2.html）對編碼蛋白亞細(xì)胞定位；SOPMA（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopm.html）預(yù)測LaAP2蛋白的二級結(jié)構(gòu)（肖向文等，2014）；利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建LaAP2系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 熒光定量PCR分析LaAP2基因的表達(dá) 獨行菜幼苗4 ℃低溫分別處理0、6、12、24 h，提取總RNA。參照Realtime PCR試劑盒說明書操作，檢測LaAP2基因的表達(dá)。所用儀器為ABI StepOne。引物序列如表2所示。

以獨行菜幼苗的cDNA為模板，克隆、測序后，得到1 005 bp片段（圖2）。ORF Finder程序預(yù)測LaAP2蛋白基因的開放閱讀框（ORF），發(fā)現(xiàn)該基因包含一個1 005 bp完整開放閱讀框。DNAMAN軟件分析該基因編碼334個氨基酸組成的多肽（圖3）。

2.2 LaAP2編碼產(chǎn)物同源性分析

對LaAP2基因編碼的氨基酸序列與8個已知物種AP2氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對（圖4）。發(fā)現(xiàn)該基因與亞麻薺CsAP2、擬南芥AtAP2、油菜BnAP2、蘿卜RsAP2、中華菊頭蝠RhsAP2、醉蝶花ThAP2、棉花GhAP2、麻瘋樹JcAP2氨基酸同源性分別為79%、78%、76%、78%、68%、64%、63%、63%。LaAP2基因編碼氨基酸序列N端存在18個氨基酸殘基的DNA結(jié)合位點“KGVVPQPNGRWGAQIYEK”，C端存在27個氨基酸殘基的DNA結(jié)合位點“GKVWRFRYSYWNSSQSYVLTKGWSRFV”，兩處氨基酸殘基序列在不同植物中具有一定的保守性。

2.3 獨行菜LaAP2理化性質(zhì)預(yù)測及結(jié)構(gòu)域分析

ExPASy ProtParam預(yù)測表明，獲得的LaAP2編碼氨基酸的理論分子量37.744 67 kD；理論等電點pI為9.49；蛋白質(zhì)分子式為C1665H2638N482O505S8，不穩(wěn)定系數(shù)為36.76，表明該蛋白為穩(wěn)定蛋白。脂溶指數(shù)為73.77，總平均親水性的數(shù)值為-0.587，預(yù)測LaAP2為親水性蛋白。

Conserved Domains進(jìn)行蛋白質(zhì)保守區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)LaAP2基因編碼氨基酸序列含有一個AP2（63～118位氨基酸）結(jié)構(gòu)域和一個B3（187～293位氨基酸）DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（圖4），屬于典型的AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子RAV亞家族基因。

2.4 獨行菜LaAP2的親水性/疏水性

Protscale分析結(jié)果（圖6）表明，獨行菜LaAP2親水性部位較多，疏水部位少。LaAP2蛋白的親水性/疏水性的最大值為176位的Val 1.889（疏水性最強），最小值為328位的Cys -3.233（親水性最強）?？傮w而言，與前面氨基酸理化性質(zhì)預(yù)測的結(jié)果一致，LaAP2蛋白屬于親水性蛋白。

2.5 獨行菜LaAP2的跨膜區(qū)、信號肽及亞細(xì)胞定位

TMpred Server進(jìn)行LaAP2蛋白跨膜區(qū)預(yù)測，表明該蛋白不具有跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白。

Signal P對LaAP2蛋白信號肽進(jìn)行預(yù)測分析，圖7結(jié)果顯示，LaAP2蛋白不具有信號肽，表明LaAP2不是一個分泌蛋白。

PSORT Ⅱ Prediction亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，LaAP2定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最高，為56.5%；其次是細(xì)胞核，為21.7%；細(xì)胞骨架為13%；過氧化物酶體和液泡都為4.3%。LaAP2可能在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮功能。

2.6 獨行菜LaAP2蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

SOPMA程序?qū)Κ毿胁薒aAP2的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。圖8結(jié)果顯示，LaAP2蛋白的二級結(jié)構(gòu)包含24.55%的α螺旋（82處）、29.94%的延伸鏈（100處）、8.98%的β折疊（30處）、36.53%的無規(guī)則卷曲（122處）。

2.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

選取GenBank上7個物種的AP2序列，利用MEGA6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹（圖9），發(fā)現(xiàn)獨行菜LaAP2與擬南芥AtAP2（NP_189201）形成的小分支，再和花椰菜BoAP2（XP_013599419）與油菜BnAP2（XP_013644813）分支組成一個大分支，而亞麻芥ClAP2（XP_010495155）、蕪菁BrAP2（XP_009148531）、醉蝶花ThAP2（XP_010528045）聚在一起位于另一個分支中。LaAP2與擬南芥的同源性最高，可信度達(dá)97%。

2.8 獨行菜幼苗冷脅迫下LaAP2基因表達(dá)分析

獨行菜幼苗4 ℃處理6 h后，LaAP2表達(dá)量只有對照的0.35倍，12 h后表達(dá)量是對照的0.16倍，24 h后表達(dá)量比12 h時表達(dá)量提高了8.4倍，是對照的1.4倍（圖10）。

3 討論

當(dāng)植物受到干旱、高鹽、低溫等生物或非生物刺激后，首先會激活脫落酸、乙烯等信號途徑，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，再通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域內(nèi)的反式作用元件特異性結(jié)合到下游靶基因啟動子區(qū)域的順式作用元件上，來激活或抑制下游功能基因的表達(dá)來完成調(diào)節(jié)作用（崔喜艷等，2015）。AP2/ERF是植物中一個大的轉(zhuǎn)錄因子家族。隨著目前測序技術(shù)的快速發(fā)展，已有多種植物的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子被分離鑒定出，如擬南芥、玉米、水稻、大豆等（崔喜艷等，2015）。它們在調(diào)控植物抵御干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫中的功能不斷被證實（Wang et al，2011；Abogadallah et al，2011；Shinwari et al，1998））。

由于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對低溫脅迫響應(yīng)方面具有重要的調(diào)控作用，該研究克隆了獨行菜AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族中一個低溫處理后顯著上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子LaAP2。獲得的LaAP2 cDNA全長序列長度為1 005 bp。生物信息學(xué)分析，LaAP2基因編碼334個氨基酸。 LaAP2編碼氨基酸序列具有一個AP2結(jié)構(gòu)域和一個B3結(jié)構(gòu)域，屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子中RAV亞家族。推定的LaAP2蛋白分子量為37.744 67 kD，等電點為9.49。該蛋白氨基酸序列同亞麻薺、擬南芥、油菜等物種顯示出較高同源性，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明與擬南芥親緣關(guān)系較近。氨基酸序列分析預(yù)測表明，LaAP2基因所編碼的蛋白不具備信號肽區(qū)段，無跨膜區(qū)域，不屬于分泌蛋白，可能為親水性蛋白，其主要二級結(jié)構(gòu)元件為無規(guī)則卷曲、延伸鏈和α螺旋，定位于細(xì)胞質(zhì)中的可能性高于細(xì)胞核中。轉(zhuǎn)錄因子一般存在于細(xì)胞核內(nèi)（阮先樂等，2017），LaAP2蛋白存在的具體位置在下一步實驗中仍需進(jìn)一步通過亞細(xì)胞定位明確。

低溫作為外界的一種非生物脅迫對植物的生長具有不利的影響。為了抵抗這種脅迫，植物具有響應(yīng)脅迫刺激的復(fù)雜的調(diào)節(jié)途徑（崔喜艷等，2015）。植物在受到低溫脅迫后，首先激活的是響應(yīng)低溫脅迫的一些轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而激活下游效應(yīng)基因的表達(dá)，通過這樣一個過程來應(yīng)對低溫脅迫對植物帶來的損傷（崔喜艷等，2015）。熒光定量PCR分析了4 ℃低溫處理不同時間獨行菜幼苗中LaAP2轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)，顯示LaAP2表達(dá)量表現(xiàn)出先降低后升高的現(xiàn)象。這表明低溫脅迫對獨行菜幼苗中LaAP2表達(dá)具有重要的影響，LaAP2可能在獨行菜耐受低溫生長中起著一定的調(diào)控作用。結(jié)合前期課題組對獨行菜表達(dá)譜的分析（周茜等，2016；周茜，2016），推測獨行菜中LaAP2轉(zhuǎn)錄因子與種子萌發(fā)、幼苗發(fā)育及耐受低溫脅迫反應(yīng)密切相關(guān)。該研究為進(jìn)一步探討LaAP2在獨行菜種子耐受低溫萌發(fā)及幼苗生長中的具體功能奠定了基礎(chǔ)。

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