宋慧東　潘潔　歐陽鵬　黃素軍　舒建昌

【摘要】目的觀察姜黃素對肝纖維化大鼠肝組織中自噬相關(guān)蛋白（Beclin1、Atg5）表達的影響，探討姜黃素介導(dǎo)的自噬對肝纖維化的影響，從自噬的視角探討姜黃素治療肝纖維化的作用機制。方法40只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組（10只）、模型組（15只）、姜黃素組（15只），正常組正常飼養(yǎng)8周，不予處理，模型組及姜黃素組予腹腔注射四氯化碳溶液，劑量為1 ml/kg，每周3次，共8周，同時姜黃素組按照每100 g體質(zhì)量給予20 mg姜黃素灌胃，每周3次，共8周。第8周末處死大鼠，留取新鮮肝組織制作蠟塊，免疫組織化學(xué)鏈親和素-酶復(fù)合物-生物素技術(shù)（SP法）檢測各組大鼠肝組織Beclin1、Atg5的表達并進行比較。結(jié)果模型組及姜黃素組較正常對照組Beclin1、Atg5表達增多，而姜黃素組中Beclin1、Atg5表達較模型組減弱（P均<0.05）。結(jié)論姜黃素抑制肝纖維化的作用機制可能與其抑制Beclin1、Atg5的表達有關(guān)，姜黃素可能通過抑制自噬來延緩肝纖維化的進展。

【關(guān)鍵詞】姜黃素；肝纖維化；自噬；Beclin1；Atg5

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of curcumin upon the expression of autophagy-related proteins （Beclin1， Atg5） in the liver tissues of rat models with liver fibrosis， evaluate the effect of autophagy induced by curcumin on liver fibrosis and investigate the underlying mechanism for the perspective of autophagy. MethodsForty male SD rats were randomly divided into the normal control（n=10）， hepatic fibrosis model（n=15） and curcumin groups（n=15）. In the normal control group， the rats were kept for 8 weeks without any intervention. In the model and curcumin groups， intraperitoneal injection of CCL4 was administered at a dose of 1 ml/kg， 3 times a week for 8 weeks. In the curcumin group， intragastric administration of curcumin was simultaneously delivered at a dose of 20 mg per 100 g weight， 3 times a week for 8 weeks. All rats were sacrificed at 8 weeks and the liver tissues were collected for paraffin embedment. The expression levels of Beclin1 and Atg 5 were quantitatively detected by immunohistochemical streptavidin-biotin peroxidase complex （SP） method. ResultsIn the model and curcumin groups， the expression levels of Beclin1 and Atg5 were significantly up-regulated than those in the normal control group， whereas the expression levels of Beclin1 and Atg5 in the curcumin group were considerably down-regulated compared with those in the model group （all P<0.05）. ConclusionThe mechanism of curcumin inhibiting liver fibrosis may be related to its inhibition of Beclin1 and Atg5 expression.Curcumin may delay the progression of liver fibrosis by inhibiting autophagy.

【Key words】Curcumin； Liver fibrosis； Autophagy； Beclin1； Atg5

目前認(rèn)為肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展與肝星狀細(xì)胞（HSC）的增殖、活化關(guān)系密切，抑制HSC活化、增殖，促進HSC凋亡，進而逆轉(zhuǎn)肝纖維化的研究是肝纖維化治療研究的主要方向[1-3]。細(xì)胞自噬在HSC增殖活化中扮演著重要的調(diào)節(jié)作用。姜黃素調(diào)控細(xì)胞自噬及治療肝纖維化的效果已有大量研究證實，但其機制仍不明。

我們的前期研究表明姜黃素能減輕肝纖維化的病理改變，對肝纖維化的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用[4]。本實驗是在前期研究基礎(chǔ)上，以四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化模型，采用免疫組織化學(xué)鏈親和素-酶復(fù)合物-生物素技術(shù)（SP法），觀察姜黃素對肝纖維化大鼠自噬相關(guān)蛋白（Beclin1、Atg5）表達的影響，探討姜黃素介導(dǎo)的自噬對肝纖維化的影響，從自噬的角度探討姜黃素治療肝纖維化的作用機制。

材料與方法

一、材料

實驗動物：健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量300～350 g，清潔級，購于中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。姜黃素購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，四氯化碳購自天津市北宏試劑廠，蘇木素、伊紅、苯胺藍(lán)、Masson三色試劑盒、Masson復(fù)合染色液均購自美國SIGMA，Beclin1多克隆抗體、Atg5多克隆抗體、DAB顯色試劑盒購自美國Proteintech公司。

二、方法

1.動物分組與處理

40只SD大鼠，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后動物隨機分為3組。正常對照組（10只）、模型組（15只）、姜黃素組（15只）。正常對照組：正常飼養(yǎng)8周，不予處理；模型組：腹腔注射四氯化碳溶液（以花生油按1∶6比例稀釋），劑量為1 ml/kg，每周3次，共8周制作肝纖維化模型；姜黃素組造模同時按照每100 g體質(zhì)量給予20 mg姜黃素灌胃，每周3次，共8周，實驗全過程按時予以普通飼料喂養(yǎng)。

2.標(biāo)本采集和處理

8周后處死大鼠留取肝臟左葉浸泡于甲醛溶液中固定1周，收集完所有標(biāo)本后，統(tǒng)一制備蠟塊。

3.Beclin1、Atg5免疫組化SP法染色

將制備的蠟塊，常規(guī)切片，脫臘入水，3% H2O2室溫孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗3 min×3 次，將切片于0.01 mmol/L檸檬酸緩沖液中微波煮沸修復(fù)10 min，常溫冷卻，PBS洗5 min×2次，室溫下用山羊血清工作液封閉1 h，甩去多余液體，勿洗，在濕盒中將載玻片鋪平，滴加適當(dāng)稀釋的一抗（Beclin1、Atg5的濃度分別為1∶150、1∶200），以PBS代替一抗作為陰性對照，置于4 ℃冰箱過夜，過夜后第2日早上將濕盒自冰箱中取出，室溫下放置30 min，PBS洗5 min×3次，滴加50～100 μl抗兔/鼠HRP標(biāo)記聚合物，37 ℃孵育30 min，同上洗滌，滴加預(yù)先制備好的DAB工作液100 μl，室溫孵育3～5 min，并同時把玻片放置在顯微鏡下觀察，用蒸餾水及時浸洗終止顯色，蒸餾水洗，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。

結(jié)果判定：每張切片選5個不同視野觀察，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，顯微鏡下胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞，并判讀陽性表達強度和陽性率。結(jié)果用半定量分析法：用染色強度與陽性細(xì)胞數(shù)百分比的乘積評分表示表達強度。染色強度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強度減去背景著色計分：無明顯著色為0分，淡黃色或輕微黃色為1分，深黃或棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分比：0%～5%為評為0分，6%～25%評1分，26%～50%評2分，51%～75%評3分，>75%均評為4分。對每個視野進行染色強度的評分與陽性細(xì)胞百分比的評分，評分結(jié)果以染色強度與陽性細(xì)胞百分比的乘積表示：0分為陰性，1～6分為弱陽性，7～12分為強陽性。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、3組大鼠肝組織中Beclin1、Atg5的陽性表達結(jié)果

顯微鏡下Beclin1的陽性表達呈棕黃色或棕褐色，主要表達于肝細(xì)胞胞漿。正常對照組Beclin1表達呈棕黃色，表達面積??；模型組胞漿可見大量的Beclin1表達，呈棕褐色，表達面積大；姜黃素組可見Beclin1表達呈棕黃色，表達面積較模型組減少，顏色也較淺，但較正常組表達面積增大，顏色也較深，見圖1。顯微鏡下Atg5的陽性表達呈棕黃色或棕褐色，主要表達于肝細(xì)胞胞漿。正常對照組Atg5表達呈棕黃色，表達面積??；模型組胞漿可見大量的Atg5表達，呈棕褐色，表達面積大；姜黃素組可見Atg5表達呈棕黃色，表達面積較模型組減少，顏色也較淺，但較正常組表達面積增大，顏色也較深，見圖2。

二、3組大鼠肝組織中Beclin1、Atg5的表達結(jié)果比較

模型組及姜黃素組較正常對照組Beclin1（P<0.001及P=0.029）、Atg5（P<0.001及P=0.010）表達增多，而姜黃素治療組中Beclin1、Atg5表達較模型組減弱（P=0.003及P=0.001），見表1。

討論

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)病理階段，激活的HSC在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。自噬是細(xì)胞進化過程中高度保守的基因調(diào)控程序，是一種溶酶體依賴途徑的降解過剩的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器的過程。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)在正常肝臟中自噬溶酶體中的酶活性非常低，生理條件下肝細(xì)胞低水平自噬維持著肝臟正常的代謝功能[6-7]。各種肝臟損傷（如酒精的消耗、四氯化碳等毒物）已經(jīng)被證實能誘導(dǎo)自噬水平升高[8]。自噬過程由多種重要的蛋白通過磷酸化與去磷酸化進行調(diào)控，其中Beclin1、Atg5參與了自噬的啟動和延伸階段，是調(diào)控自噬的關(guān)鍵基因。Beclin1又稱為BECN1，是首個被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)自噬的相關(guān)基因，它是Atg6基因的同源產(chǎn)物，編碼一種分子量為60 ku的蛋白。目前，人們普遍認(rèn)為Beclin1是調(diào)控自噬的一種關(guān)鍵蛋白，作為自噬啟動過程中的關(guān)鍵蛋白，Beclin1是最被廣泛應(yīng)用于研究自噬的自噬分子標(biāo)記物之一。Atg5是參與自噬體形成的重要基因，Atg5通常是以與Atg12結(jié)合形成復(fù)合物的形式存在，在一些真核細(xì)胞中，幾乎所有的Atg5和Atg12都以結(jié)合成復(fù)合物的形式存在。Atg5-Atg12復(fù)合物在自噬體膜的延伸階段起著關(guān)鍵的作用。據(jù)報道，在動物模型中敲除Atg5能使自噬水平下降，發(fā)生基因突變的 Atg5不能與Atg12結(jié)合成復(fù)合物，從而阻止自噬體的形成[9]。因此，Atg5 也是調(diào)控細(xì)胞自噬的一個關(guān)鍵基因，是被廣泛應(yīng)用于研究自噬的自噬分子標(biāo)記物。

在本實驗中四氯化碳作為一種造成肝損傷的毒性物質(zhì)，在造成肝損傷的同時也能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來參與肝纖維化的進程，國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)自噬為HSC的活化提供能量支持[10]。因此認(rèn)為自噬促進了HSC活化從而參與了肝纖維化的形成。Thoen等（2011年）用特異性抑制劑抑制自噬或敲除自噬相關(guān)基因Atg的表達則ATP的水平明顯降低、并能使活化的HSC轉(zhuǎn)為靜息型。Hernndez-Gea等[11]用四氯化碳制作小鼠肝纖維化模型，并利用特性性自噬抑制劑或敲除自噬相關(guān)基因阻斷HSC的自噬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝纖維化模型小鼠自噬水平明顯升高，阻斷鼠HSC的自噬則減少了肝纖維化的形成和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。由此，肝星狀細(xì)胞中自噬的激活在肝纖維形成中至關(guān)重要，選擇性地抑制HSC的自噬或許可用于治療肝纖維化。

抗肝纖維化的實驗研究已經(jīng)取得很大進展，很多藥物在嚙齒動物研究中被證明抗肝纖維化是有效的[12]。本研究小組既往研究已經(jīng)證實姜黃素具有預(yù)防和治療肝纖維化的作用，并探討了其有關(guān)作用機制[13-14]。本實驗是結(jié)合以往系列研究成果，用姜黃素作用于肝纖維化大鼠模型，觀察姜黃素的抗肝纖維化作用及自噬相關(guān)蛋白表達，進一步探索姜黃素抗肝纖維化的作用機制。結(jié)果顯示，模型組及姜黃素組較正常對照組Beclin1、Atg5表達明顯增多，再次證實肝纖維化模型中自噬水平升高，而姜黃素治療組中Beclin1、Atg5表達明顯較模型組減弱，說明姜黃素在肝纖維化動物模型中能明顯減少Beclin1、Atg5的表達，降低自噬水平。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上進一步證實了姜黃素具有抑制HSC活化的作用，其機制可能與其抑制Beclin1、Atg5的表達有關(guān)，姜黃素可能通過抑制自噬來抑制HSC活化從而延緩肝纖維化的進展。

本研究從細(xì)胞自噬這一新的視角探討姜黃素治療肝纖維化的機制，為姜黃素治療肝纖維化的臨床應(yīng)用提供了進一步的證據(jù)支持，拓寬了肝纖維化治療的視野，為臨床肝纖維化治療研究提供新思路和潛在治療靶點。

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（收稿日期：2018-03-08）

（本文編輯：楊江瑜）