劉峰

（山東省日照市動物疫病預(yù)防控制中心 276800）

日照市位于蘇魯交界的黃海之濱，為國家膠東半島免疫無口蹄疫緩沖區(qū)。為了解全市豬A型口蹄疫疫情風(fēng)險，2018年3月日照市根據(jù)全省統(tǒng)一部署開展了對養(yǎng)殖場、屠宰場和無害化處理廠的專項調(diào)查。通過深入養(yǎng)豬場查看和流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，豬群整體狀況良好，無口蹄疫癥狀。在未免疫豬A型口蹄疫疫苗的豬場采集了豬血樣60份，進(jìn)行豬A型口蹄疫液相阻斷ELISA抗體檢測，未檢測到A型口蹄疫抗體；采集了屠宰場、無害化處理廠豬淋巴結(jié)和扁桃體各60份，進(jìn)行豬口蹄疫病毒熒光RT-PCR試驗，結(jié)果均為陰性。綜上所述，日照市目前未發(fā)現(xiàn)豬A型口蹄疫病例，但如果疏于日常管理也可能導(dǎo)致疫情發(fā)生。

1 檢測

1.1 豬A型口蹄疫液相阻斷ELISA抗體檢測試驗

檢測依據(jù)∶GB/T18935-2003。

1.1.1 樣品概述

采集自未免疫豬A型口蹄疫疫苗的豬場，豬只前腔靜脈采血，離心收集血清60份，液體、澄清、淺黃色。

1.1.2 主要儀器

全波長酶標(biāo)儀（MultiskanGO，美國賽默飛）、電熱恒溫干燥箱（GZX_9140，上海博迅）、超純水儀（Cascada，美國PALL）， 移液器（Biohit， 芬蘭百得）。

1.1.3 診斷試劑

蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的口蹄疫A型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，批號：20170906103-2。

1.1.4 檢驗室環(huán)境

溫度：25℃，濕度：55%。

1.1.5 檢測時間

20180323-20180324。

1.1.6 主要操作步驟

（1）抗原抗體反應(yīng)：在U型血凝板上將待檢血清從1∶16倍比稀釋至1∶128，然后每空加稀釋的病毒抗原50ul，封板，4℃過夜。（2）ELISA板洗5次，將抗原抗體混合物50ul移至ELISA板上，37℃1h。（3）洗5次，加入50ul豚鼠抗血清，37℃30min。（4） 洗5次， 加入50ul酶結(jié)合物，37℃30min。（5） 洗5次， 加入50ul底物， 37℃15min。（6） 加入50ul終止液，立即在450nm波長讀取光吸收值。

1.2 豬口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測試驗

檢測依據(jù)∶GB/T27528-2011。

1.2.1 樣品概述

采集自屠宰場、無害化處理廠的豬淋巴結(jié)和扁桃體各60份，固體、組織。

1.2.2 主要儀器

II級生物安全柜（AC24，新西蘭）、熒光RT-PCR儀（7500， 美國 ABI）、 移液器（Biohit,芬蘭百得）。

1.2.3 診斷試劑

北京生科生產(chǎn)的豬口蹄疫病毒熒光RT-PCR試劑盒，批號： 20170901。

1.2.4 檢驗室環(huán)境

溫度：25℃，濕度：55%。

1.2.5 檢測時間

2018年3月25日至2018年3月26日。

1.2.6 主要操作程序

（1）樣品處理：稱樣品1g,用手術(shù)剪刀剪碎混勻后取0.05g于研磨缽中研磨，加入1.5ml生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5ml滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清200ul置于1.5ml滅菌離心管中。

（2）病毒模板RNA提取：收集200ul樣品或陰陽性對照，加入1.5ml滅菌離心管中；加200ulBufferV-L，漩渦振蕩混合均勻，靜置5min；75ulBufferV-N，A漩渦振蕩混合均勻，12000×g離心5min；將上清液轉(zhuǎn)移到新的2ml離心管中，加300ul異丙醇，上下倒置6～8次，混合均勻；將植被管置于2ml離心管中，取上一步的混合液移入植被管，6000×g離心1min；將植被管置回到2ml離心管中，12000×g離心1min，將植被管置于清潔的1.5ml離心管中，在植被管膜中央加60ul-BufferTE，室溫靜置1min，12000×g離心1min，洗脫RNA。

（3）反應(yīng)液配制：反應(yīng)體系按照RT-PCR反應(yīng)液15ulTab酶0.25ul進(jìn)行配制，每個反應(yīng)管中加入上述反應(yīng)體系15ul，加樣10ul，放入儀器中。

（4） 熒光 RT-PCR 反應(yīng)： 42℃30min； 92℃3min； 92℃10s， 45℃30s， 72℃1min， 5個循環(huán)； 92℃10s， 60℃30s， 40個循環(huán)，熒光收集設(shè)備在第四階段每次循環(huán)退火延伸時進(jìn)行。

2 結(jié)果

根據(jù)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，被檢測的60份樣本中未檢測到A型口蹄疫抗體，詳見表1。

根據(jù)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，120份被檢測樣本中未發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒，詳見表2。

3 分析

本次檢測受檢測時間和樣本數(shù)量限制，代表廣泛性不是很強(qiáng)。但通過對調(diào)查問卷中的飼養(yǎng)情況、調(diào)運(yùn)檢疫情況、疫苗接種情況統(tǒng)計和養(yǎng)豬場的地理位置、疾病防治、消毒、用藥、發(fā)病史、發(fā)病數(shù)、環(huán)境衛(wèi)生狀況分析，結(jié)合實(shí)驗室檢測數(shù)據(jù)，可以認(rèn)為日照市未發(fā)現(xiàn)豬A型口蹄疫病例，但存在可能導(dǎo)致疫情發(fā)生的諸多不安全隱患。

表2 豬口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測試驗結(jié)果

（1）個別養(yǎng)殖戶管理不規(guī)范，檔案記錄不全。豬有病不能及時發(fā)現(xiàn)，死豬后不能及時無害化處理，疫情不按時上報。特別是對豬口蹄疫危害認(rèn)識不足，及時免疫不規(guī)范。

（2）個別散養(yǎng)戶豬場消毒設(shè)施設(shè)備不全，車輛人員隨便出入，場區(qū)不能按時消毒。

（3）新引進(jìn)的豬只不進(jìn)行隔離觀察和口蹄疫檢測，存在引進(jìn)陰性帶毒個體的風(fēng)險性。

（4）大部分養(yǎng)殖場不能及時進(jìn)行免疫抗體檢測，不能主動進(jìn)行特種疫病凈化。

（5）畜禽交易、屠宰、產(chǎn)品加工等場所的排污、環(huán)境消毒等環(huán)節(jié)，缺少有效監(jiān)管。

4 建議

（1）大力宣傳口蹄疫的危險性和危害性，強(qiáng)化以消毒滅源為主的生物安全防范措施，抓好養(yǎng)殖場日常管理。

（2）繼續(xù)做好牛羊O/A型和豬O型口蹄疫疫苗強(qiáng)制免疫工作，并及時補(bǔ)免。

（3）定期開展實(shí)驗室抗體監(jiān)測和疫病檢測，及時發(fā)現(xiàn)隱患，加強(qiáng)動物疫情測報與信息交流。

（4）加強(qiáng)檢疫監(jiān)督。強(qiáng)化產(chǎn)地檢疫、屠宰檢疫和調(diào)運(yùn)監(jiān)管，嚴(yán)防輸入性疫病的發(fā)生。

（5）通過優(yōu)惠政策扶持養(yǎng)殖場主動進(jìn)行特種疫病凈化，提高病死畜禽的無害化處理率，及時消滅疫病傳染源。