李惠民 ，羅芬蘭，賀軍民

1. 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，西安 710062

2. 商洛職業(yè)技術(shù)學(xué)院，商洛 726000

隨著工業(yè)化進(jìn)程的加速，重金屬污染已成為當(dāng)今世界關(guān)注的熱點問題之一。Cd2+是比較常見的重金屬污染物，因此關(guān)于Cd2+脅迫對植物生活的影響已受到廣泛關(guān)注（林單等，2010）。DNA是遺傳信息的載體，其含量和正常結(jié)構(gòu)的維持是生物體生命活動的基礎(chǔ)。一些研究顯示，Cd2+脅迫不僅能影響DNA的合成和降解，導(dǎo)致DNA含量的降低（Tuteja et al，2001；郭燕梅等，2008；林單等，2010），而且能引起DNA鏈的斷裂、鏈內(nèi)和鏈間的交聯(lián)、甲基化水平、構(gòu)象和多態(tài)性等多方面的改變（陳霞等，2001；Atienzar et al，2002；劉宛等，2006；馬引利和佘小平，2006；李慧等，2010；張芬琴等，2012）。光合作用是植物最基本的物質(zhì)代謝和能量代謝，是唯一能把太陽能轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的化學(xué)能貯藏在有機物中的過程。大量研究表明，Cd2+脅迫能降低植物光合速率、氣孔導(dǎo)度、光合色素含量、光系統(tǒng)的光化學(xué)效率、光合電子傳遞效率、光合磷酸化效率和光合碳同化過程中許多酶的活性，也能導(dǎo)致聚光色素復(fù)合體的解聚和葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞（Weigel，1985；Ghoshroy and Nadakavukaren，1990；Padmaja et al，1990；Sheoran et al，1990；Malik et al，1992；陳國祥等，1999）。盡管前人對Cd2+脅迫影響光合作用的機制進(jìn)行了大量研究，但對Cd2+脅迫抑制光合作用過程中到底是氣孔限制還是葉肉細(xì)胞光合活性的變化起了主要作用卻并不清楚。同時，探尋安全而有效的防護措施來緩解Cd2+污染對植物的毒害作用，進(jìn)而提高農(nóng)作物的產(chǎn)量已顯得尤為重要，但目前該方面的研究仍較薄弱。

一氧化氮（NO）是一種新型信號分子，在植物的生長發(fā)育、防御反應(yīng)以及抗逆性等方面都發(fā)揮著重要的作用（Fancy et al，2017）。已有研究表明NO能緩解一些逆境對植物的毒害效應(yīng)，如：外源 NO提高植物抗旱性（李蕾蕾，2016）；增強農(nóng)作物的抗寒性（馬向麗等，2005；牟雪姣和張遠(yuǎn)兵，2015）；減輕鹽脅迫下植物葉片的膜脂過氧化（陳明等，2004）；延緩植物在鹽脅迫和高溫脅迫下葉片葉綠素的降解，維持光系統(tǒng)Ⅱ的高活性（Akio et al，2002）等。然而，目前關(guān)于NO對重金屬脅迫抑制植物生長發(fā)育的影響的研究工作較少，特別是外源NO對重金屬Cd2+脅迫下農(nóng)作物的影響的研究工作更少。

基于以上分析，本文研究了外源NO處理對Cd2+脅迫下綠豆幼苗DNA及光合作用的影響，旨在探討NO是否能有效緩解重金屬脅迫對植物的毒害效應(yīng)及其作用機制，同時為有效防護重金屬污染對農(nóng)作物的影響提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)及處理

綠豆（Phaseolus raditus L. cv. Qindou-20）種子購于陜西省西安市雁塔區(qū)種子公司。種子經(jīng)0.1%HgCl2溶液消毒5 min后立即用流水沖洗干凈，再用去離子水沖洗3次，然后于暗中、25℃溫箱內(nèi)預(yù)萌發(fā)60 h。選擇萌發(fā)一致的種子培養(yǎng)于盛有去離子水的塑料管中，置于光照培養(yǎng)箱（晝/夜溫度(25 ± 2)℃ /(20 ± 2)℃，相對濕度75%，每日光照14 h，光強為 300 — 350 μmol ? m?2? s?1）中培養(yǎng)。

培養(yǎng)33 h后，保持上述條件不變，進(jìn)行以下四種處理：①對照組（CK）：用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)；②NO供體硝普鈉（SNP）處理組（SNP）：用含 50 μmol ? L?1SNP 的 1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)；③重金屬鎘脅迫組（Cd）：先用1/2 Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng) 24 h 后，改用含 5 μmol ? L?1CdCl2的1/2 Hoagland營養(yǎng)液一直培養(yǎng)；④ 鎘脅迫和SNP復(fù)合處理組（Cd+SNP）：先用含50 μmol ? L?1SNP 的 1/2 Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng) 24 h后，改用含 50 μmol ? L?1SNP 和 5 μmol ? L?1CdCl2的1/2 Hoagland營養(yǎng)液一直培養(yǎng)。

每處理組30株幼苗，每天更換一次處理液，在處理后的第3天（3 d）和第8天（8 d）取幼苗的葉片和根進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。

1.2 DNA的提取

采用CTAB法提取綠豆幼苗葉片DNA和根DNA：分別稱取處理3 d和8 d的葉片各0.8 g，處理3 d和8 d的根各1.0 g，加入4℃冷藏的DNA提取液 （2 g ? L?1CTAB，1.4 mol ? L?1NaCl，20 mmol ? L?1EDTA，100 mmol ? L?1Tris-HCl 和 2 mL ? L?1巰 基乙醇）1.5 mL充分研磨至勻漿，裝入2 mL離心管內(nèi)，60℃水浴中保溫40 min，期間不時輕輕搖動。冷卻后 12000 r ? min?1離心 20 min,取上清液加RNA酶10 μL，搖勻于37℃水浴中保溫40 min，加等體積氯仿-異戊醇（氯仿和異戊醇按體積比24∶1 配 制 氯 仿 -異 戊 醇） 于 12000 r ? min?1離 心15 min，取上清液再加等體積氯仿-異戊醇（氯仿和異戊醇按體積比24∶1配制氯仿-異戊醇）再次抽提蛋白質(zhì)（12000 r ? min?1，15 min）。異丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌兩次。將洗滌后的DNA沉淀于通風(fēng)柜中風(fēng)干，溶于80 mL TE緩沖液（10 mmol ? L?1Tris-HCl，1 mmol ? L?1EDTA，pH 8.0）中，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA含量測定

分別取上述葉片和根系DNA提取液20 μL，用TE緩沖液稀釋至3 mL，在TU-1800S型紫外 — 可見分光光度計上測定A260和A280，以A260值估算DNA得率，以A260/ A280比值判斷DNA樣品的純度。DNA 含量以 μg ? g?1DW 表示。

1.4 DNA增色效應(yīng)測定

分別取兩份上述各處理葉片和根系DNA樣品各 20 μL，溶于 3 mL 0.08 mol ? L?1NaCl溶液中，一份在70℃水浴中加熱，另一份置于室溫（25℃）下。30 min后分別在TU-1800S型紫外 — 可見分光光度計上測定 A260，以 [(A260,70℃? A260,25℃) /A260,25℃]×100%作為DNA增色效應(yīng)指標(biāo)。

1.5 光合指標(biāo)的測定

凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、細(xì)胞間隙CO2濃度（Ci）均用便攜式CIRAS-2型光合測定儀（PP Systems公司制造）測定。每項光合指標(biāo)的測定均選取綠豆幼苗第一對真葉。測定過程葉室溫度 25℃，CO2濃度 390 μmol ? mol?1，光強1000 μmol ? m?2? s?1。測定時間為每日 13:30 — 16:00。試驗重復(fù)3次以上。

氣孔限制值（Ls）根據(jù)Farquhar and Sharkey（1982）的理論由Pn/ Ci和Pn/ Ca兩條響應(yīng)曲線計算得出。Ls= (Ao? Ai)/Ao×100%，式中 Ao為 Ci等于大氣CO2濃度時幼苗葉片的Pn，Ai為大氣CO2濃度下幼苗葉片的Pn。

2 試驗結(jié)果

2.1 NO對Cd2+脅迫下綠豆幼苗DNA的影響

2.1.1 NO對Cd2+脅迫下綠豆幼苗DNA含量的影響圖1和圖2表明，NO供體SNP單獨處理對綠豆幼苗葉片和根系的DNA含量基本沒有影響；單獨Cd2+脅迫3 d和8 d均極顯著地降低了綠豆幼苗葉片和根系的DNA含量（p ＜ 0.01）；而在Cd2+脅迫下增加SNP復(fù)合處理時，Cd2+脅迫引起的幼苗葉片和根系的DNA含量降低均得到極顯著的抑制（p ＜ 0.01），但仍低于對照組幼苗葉片和根系的DNA含量。與Cd2+單獨處理相比，Cd+SNP處理3 d使綠豆幼苗葉片和根系的DNA含量分別增加了51.48%和31.46%，處理8 d使綠豆幼苗葉片和根系DNA含量分別增加31.85%和44.62%，這表明NO處理顯著減緩了Cd2+單獨處理對綠豆幼苗葉片和根系DNA含量的影響。

2.1.2 NO對Cd2+脅迫下綠豆幼苗DNA鏈間交聯(lián)的影響

由圖3和圖4可知，與對照相比，NO供體SNP單獨處理對綠豆幼苗葉片和根系的DNA增色效應(yīng)均無顯著影響；單獨Cd2+脅迫3 d和8 d時綠豆幼苗葉片和根系的DNA增色效應(yīng)較對照相比均極顯著降低（p ＜ 0.01）；SNP和Cd2+復(fù)合處理時極顯著地緩解了Cd2+單獨處理（3 d和8 d ）造成的綠豆幼苗葉片和根系DNA增色效應(yīng)的降低（p ＜ 0.01）。與Cd2+單獨處理相比，Cd+SNP處理3 d使綠豆幼苗葉片和根系DNA增色效應(yīng)分別增加了52.37%和59.85%，處理8 d使綠豆幼苗葉片和根系DNA增色效應(yīng)分別增加214.60%和77.24%。

圖1 NO對Cd2+脅迫3 d綠豆幼苗葉片和根系DNA含量的影響Fig.1 Effects of NO on the contents of DNA in the leaves and roots of mung bean seedlings treated with Cd2+ for three days

圖2 NO對Cd2+脅迫8 d綠豆幼苗葉片和根系DNA含量的影響Fig.2 Effects of NO on the contents of DNA in the leaves and roots of mung bean seedlings treated with Cd2+ for eight days

圖3 NO對Cd2+脅迫3 d綠豆幼苗葉片和根系DNA增色效應(yīng)的影響Fig.3 Effects of NO on DNA hyperchromicity in the leaves and roots of mung bean seedlings treated with Cd2+ for three days

圖4 NO對Cd2+脅迫8 d綠豆幼苗葉片和根系DNA增色效應(yīng)的影響Fig.4 Effects of NO on DNA hyperchromicity in the leaves and roots of mung bean seedlings treated with Cd2+ for eight days

DNA增色效應(yīng)反映了DNA鏈間的交聯(lián)程度。增色效應(yīng)越低，說明DNA兩條鏈間交聯(lián)程度越大。由試驗結(jié)果可知，Cd2+脅迫引起綠豆幼苗葉片和根系DNA鏈間交聯(lián)程度增高；NO對正常生長條件下幼苗DNA鏈間交聯(lián)程度無明顯影響，但能顯著抑制Cd2+脅迫造成的DNA鏈間交聯(lián)。

2.2 NO對Cd2+脅迫下綠豆幼苗葉片光合作用的影響

2.2.1 NO對Cd2+脅迫下綠豆幼苗葉片Pn的影響

由圖5可見，與對照相比， Cd2+脅迫3 d和8 d均極顯著降低了綠豆幼苗葉片Pn（p ＜ 0.01）；NO供體SNP單獨處理3 d對綠豆幼苗Pn無明顯影響，但處理8 d時有一定的抑制；與Cd2+單獨處理相比，SNP和Cd2+復(fù)合處理3 d和8 d時綠豆幼苗葉片Pn均極顯著升高（p ＜ 0.01），復(fù)合處理3 d和8 d時綠豆幼苗Pn分別升高了38.63%和63.03%。說明NO緩解了Cd2+脅迫對綠豆幼苗光合作用的抑制。

2.2.2 NO對Cd2+脅迫下綠豆幼苗Gs的影響

光合作用固定的CO2主要是通過氣孔進(jìn)入植物體內(nèi)，因而氣孔的開放和關(guān)閉必然影響植物的光合作用。圖6表明，與對照相比，SNP單獨處理、Cd2+脅迫單獨處理、SNP和Cd2+復(fù)合處理3 d和8 d的綠豆幼苗Gs均極顯著下降（p ＜ 0.01），其中以Cd2+單獨處理最為嚴(yán)重，而復(fù)合處理下的Gs明顯高于Cd2+單獨處理?？梢?，各處理下氣孔導(dǎo)度的變化趨勢與光合速率的變化趨勢基本相同。

2.2.3 NO對Cd2+脅迫下綠豆幼苗葉片Ci和Ls的影響

雖然各處理下光合速率的變化和氣孔導(dǎo)度的變化趨勢基本相同（圖5 、 圖6），但這并不能說明導(dǎo)致光合速率變化主要是氣孔因素。由圖7和圖8可知，單獨Cd2+脅迫下，伴隨著Pn和Gs顯著低于對照（圖5 、圖6），Ci也明顯低于對照，而Ls則顯著高于對照，說明單獨Cd2+脅迫造成光合速率下降主要是氣孔因素。Cd+SNP復(fù)合處理下，雖然Pn和Gs均顯著高于單獨Cd2+脅迫處理，但Ci略低于單獨Cd2+脅迫（圖7），Ls明顯低于Cd2+脅迫（圖8），說明復(fù)合處理下幼苗Pn高于單獨Cd2+脅迫主要是葉肉細(xì)胞光合活性的提高所導(dǎo)致。

圖5 NO對Cd2+脅迫3 d（左）和8 d（右）綠豆幼苗Pn的影響Fig.5 Effects of NO on Pn of mung bean leaves treated with Cd2+ for three days (left) and eight days (right)

圖6 NO對Cd2+脅迫3 d（左）和8 d（右）綠豆幼苗Gs的影響Fig.6 Effects of NO on Gs of mung bean leaves treated with Cd2+ for three days (left) and eight

圖7 NO對Cd2+脅迫3 d（左）和8 d（右）綠豆幼苗葉片Ci的影響Fig.7 Effects of NO on Ci of mung bean leaves treated with Cd2+ for three days (left) and eight days (right)

圖8 NO對Cd2+脅迫3 d（左）和8 d（右）綠豆幼苗葉片Ls的影響Fig.8 Effects of NO on Ls of mung bean leaves treated with Cd2+ for three days (left) and eight days (right)

3 討論及結(jié)論

3.1 NO對Cd2+脅迫下綠豆幼苗DNA含量和鏈間交聯(lián)的影響

生物的生命活動與DNA表達(dá)密不可分，重金屬脅迫常導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)和含量的變化而影響其正常表達(dá)，這不僅影響生物遺傳的穩(wěn)定性，而且影響其本身的正常生長發(fā)育（Tuteja et al，2001）。陳霞等（2001）以鮭魚精子DNA為試驗樣品，通過紫外測量、圓二色譜及喇曼光譜測量，結(jié)果表明Cd2+可與DNA發(fā)生作用，并且使DNA構(gòu)象發(fā)生變化。在植物中，前人研究也表明Cd2+不僅影響DNA的代謝，而且導(dǎo)致DNA鏈斷裂、交聯(lián)和堿基錯誤配對等結(jié)構(gòu)的變化（劉宛等，2006；郭燕梅等，2008；李慧等，2010；林單等，2010；張芬琴等，2012）。Koch and Giandomenico（1994）指出，DNA增色效應(yīng)可反映DNA的解鏈程度，而DNA解鏈程度與其鏈長及鏈間交聯(lián)程度有關(guān)，DNA斷裂會使鏈長變短因而增色效應(yīng)提高，DNA鏈間交聯(lián)則使增色效應(yīng)下降，因此前人常用DNA增色效應(yīng)的結(jié)果判斷DNA是否斷裂以及是否發(fā)生了鏈間交聯(lián)等損傷效應(yīng)（馬引利和佘小平，2006；李慧等，2010）。與前人研究結(jié)果相一致，本文試驗結(jié)果表明，Cd2+脅迫3 d和8 d導(dǎo)致綠豆幼苗葉片和根系DNA含量和DNA增色效應(yīng)均極顯著降低（p ＜ 0.01）（圖1 — 4），說明Cd2+導(dǎo)致綠豆幼苗葉片和根系DNA代謝受到抑制，DNA鏈間交聯(lián)程度加劇。DNA鏈間交聯(lián)抑制轉(zhuǎn)錄過程，DNA含量的大幅度降低也影響功能mRNA的形成，因而不管是DNA交聯(lián)還是DNA含量降低均對植物的正常生長發(fā)育是有害的，它們勢必導(dǎo)致植物的生理傷害和生長受阻，這與Cd2+脅迫抑制綠豆幼苗生長的研究結(jié)果是一致的（李艷艷等，2012）。

陳明等（2004）發(fā)現(xiàn)NO供體SNP能明顯減輕NaCl脅迫對小麥幼苗根生長的抑制效應(yīng)，這與其阻斷鹽脅迫誘導(dǎo)的根尖細(xì)胞DNA的片段化有關(guān)。李艷艷等（2012）的研究發(fā)現(xiàn)外源NO處理能明顯緩解Cd2+脅迫對綠豆幼苗生長的抑制效應(yīng)，但該緩解效應(yīng)是否與外源NO處理抑制了Cd2+脅迫下綠豆幼苗DNA含量降低和DNA鏈間交聯(lián)的發(fā)生有關(guān)卻并不清楚。本文試驗結(jié)果顯示，NO供體SNP和重金屬Cd2+復(fù)合處理顯著提高了Cd2+脅迫3 d和8 d的綠豆幼苗葉片和根系的DNA含量（圖1 、圖2）和DNA增色效應(yīng)（圖3 、 圖4）（p ＜ 0.05），說明NO能緩解重金屬Cd2+脅迫對綠豆幼苗DNA結(jié)構(gòu)及其代謝的影響，這可能是NO緩解Cd2+脅迫對植物生長抑制效應(yīng)的原因之一。

3.2 NO對Cd2+脅迫下綠豆幼苗光合作用的影響

目前，普遍認(rèn)為Cd2+脅迫對植物光合作用的毒性主要與其干擾光合鏈的電子傳遞和導(dǎo)致光合酶失活等有關(guān)（郭燕梅等，2008；李慧等，2010），如：研究顯示植物受Cd2+脅迫時，光合作用暗反應(yīng)過程中許多酶的活性降低（Sheoran et al，1990；Malik et al，1992）；Cd2+影響光合膜和光系統(tǒng)Ⅱ的結(jié)構(gòu)等（Weigel，1985；Ghoshroy and Nadakavukaren，1990；Padmaja et al，1990；陳國祥等，1999）；光合作用的順利進(jìn)行與光合底物CO2的供應(yīng)密切相關(guān)，而目前關(guān)于Cd2+脅迫抑制光合作用是否也與其影響光合底物CO2的供應(yīng)有關(guān)卻并不清楚。Farquhar and Sharkey（1982）將限制光合作用的因素歸納為兩大類：一是與CO2供應(yīng)有關(guān)的因素，主要包括界面層及氣孔對CO2的擴散阻力，其中以氣孔阻力影響最大，可簡稱為氣孔因素；二是與光能轉(zhuǎn)化和碳同化有關(guān)的葉肉因素，統(tǒng)稱為非氣孔因素。根據(jù)Farquhar and Sharkey（1982）的理論，Gs和Ci降低而Ls增加時，Pn降低的主要原因為氣孔因素，而Pn降低伴隨著Ci升高時，Pn降低的主要原因一定是非氣孔因素（許大全，1997）。本文結(jié)果顯示，與對照相比，Cd2+脅迫3 d和8 d時綠豆幼苗的Pn、Gs和Ci均顯著降低，而Ls卻顯著升高（p ＜ 0.01）（圖5 — 8），說明Cd2+脅迫3 d和8 d時導(dǎo)致綠豆幼苗Pn降低的主要原因是氣孔因素，而不是非氣孔因素。本文試驗中Cd2+脅迫處理時間較短，結(jié)合前人較長時間的Cd2+脅迫處理或高強度的Cd2+脅迫處理對植物葉肉因素影響的測定結(jié)果（Ghoshroy and Nadakavukaren，1990；Padmaja et al，1990；Sheoran et al，1990；Malik et al，1992；陳國祥等，1999），本文認(rèn)為Cd2+脅迫前期限制植物光合作用的主要原因是氣孔因素，而脅迫后期限制植物光合作用的主要原因是非氣孔因素。

李蕾蕾（2016）發(fā)現(xiàn)，外源NO處理能夠增加干旱脅迫下玉米幼苗葉綠體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，減輕PSⅡ反應(yīng)中心的受損程度，提高光合碳同化過程相關(guān)基因的表達(dá)及酶活性，進(jìn)而緩解了干旱對玉米幼苗光合作用的抑制；王松等（2016）研究表明，外源NO通過誘導(dǎo)上調(diào)NaCl脅迫下番茄幼苗光合色素含量、PSⅡ的光化學(xué)反應(yīng)活性以及降低光抑制，從而緩解了NaCl脅迫對番茄幼苗生長的抑制；孫德智等（2014）也表明外施SNP能有效抑制NaCl脅迫下番茄幼苗葉片光合色素含量、Pn和Gs的下降以及Ci的升高。外源NO對干旱和鹽等逆境條件下植物光合作用的影響已有較多研究，但關(guān)于外源NO對重金屬Cd2+脅迫下植物光合作用影響的研究卻較少。本文結(jié)果顯示，外源NO供體SNP使Cd2+脅迫3 d和8 d時綠豆幼苗的Pn和Gs均顯著升高（圖5 、 圖6），Ls顯著降低（圖8），但使Ci有一定程度的下降（圖7），說明外源NO緩解Cd2+脅迫抑制綠豆幼苗光合作用主要是由非氣孔因素導(dǎo)致，這與前人表明的NO緩解干旱和鹽脅迫等逆境抑制植物光合作用的機制是一致的（孫德智等，2014；李蕾蕾，2016；王松等，2016）。

綜上所述，短時間的Cd2+脅迫處理導(dǎo)致了綠豆幼苗DNA代謝及其結(jié)構(gòu)的損傷，并主要通過氣孔限制抑制了綠豆幼苗葉片的光合作用。而外源NO處理能明顯緩解Cd2+脅迫對綠豆幼苗DNA代謝及其結(jié)構(gòu)的損傷，并通過提高幼苗葉肉細(xì)胞的光合活性，緩解了Cd2+脅迫對幼苗光合作用的抑制，進(jìn)而增強了植物對重金屬Cd2+脅迫的抵抗力。