王 樂，李海琴，王美玲，張校亮，李曉春

(太原理工大學(xué) 新型傳感器與智能控制教育部與山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，物理與光電工程學(xué)院，山西 太原 030024)

磺胺類抗生素是以對(duì)位氨基苯磺酰胺為基本結(jié)構(gòu)衍生出的一類具有抗菌作用的特效藥[1]，雖在人類疾病的治療中起到了重要作用，但過量使用會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用，主要表現(xiàn)為毒性損傷、變態(tài)反應(yīng)、過敏反應(yīng)以及致癌、致畸、致突變“三致”效應(yīng)。隨著社會(huì)發(fā)展和人民生活水平的提高，抗生素的種類和用量不斷增加，因不合理使用而產(chǎn)生不良影響的現(xiàn)象變得日益突出[2]。由于長期的不合理使用，各種含有大量抗生素的污水從工廠、養(yǎng)殖場(chǎng)排出，造成了對(duì)環(huán)境的嚴(yán)重污染。環(huán)境中的抗生素會(huì)導(dǎo)致生物體內(nèi)產(chǎn)生耐藥性基因，并對(duì)水生生物及人體產(chǎn)生危害。

目前，國內(nèi)外用于檢測(cè)抗生素的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[3-5]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、毛細(xì)管電泳法(CE)[7]、免疫分析方法[8-9]以及熒光光度法[10]等。其中高效液相色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的靈敏度和準(zhǔn)確度高；毛細(xì)管電泳法主要用于少量樣本的定量分析，具有分離效率高、節(jié)省試劑的優(yōu)點(diǎn)；免疫分析方法檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、特異性好。但以上方法需要大型儀器、操作復(fù)雜，因此不適合于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。

核酸適體(適體鏈)是一小段的DNA或RNA片段[11]，一般由30多個(gè)堿基組成。它是利用指數(shù)富集的配體進(jìn)化技術(shù)(SELEX)從堿基庫中篩選而來。由于適體鏈的出現(xiàn)，基于適體鏈的特異性檢測(cè)抗生素的方法逐漸出現(xiàn)。2012年韓國Song等[12]首次利用SELEX方法篩選出磺胺二甲嘧啶(SDM)的適體，并利用該適體鏈結(jié)合熒光方法實(shí)現(xiàn)了SDM的檢測(cè)，檢出限為0.01 μg/mL，具有良好的特異性。陳愛亮課題組[13]提出了一種無需標(biāo)記的基于適體-納米金結(jié)構(gòu)的SDM檢測(cè)方法，該方法的線性范圍為0～1 μg/mL，檢出限為0.05 μg/mL。干寧等[14]提出了一種使用適體-雙鏈DNA抗體-量子點(diǎn)探針結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)增強(qiáng)的氯霉素(CAP)的定量檢測(cè)方法。

基于以上研究，并結(jié)合納米金的聚集比色原理，本文提出了一種以納米金顆粒與適體鏈為檢測(cè)結(jié)構(gòu)，同時(shí)利用智能手機(jī)補(bǔ)色波長分析檢測(cè)磺胺類抗生素SDM的方法。該方法克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法對(duì)大型儀器的依賴，利用普通的智能手機(jī)對(duì)溶液進(jìn)行拍照，通過App分析圖片的補(bǔ)色波長實(shí)現(xiàn)了SDM的定量檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV-3100紫外-可見光分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；TKAGenpure UV超純水系統(tǒng)(美國賽默飛世爾公司)；78 HW-1數(shù)顯磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)有限公司)；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；HC-2518高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器)；混合器(德國IKA公司)；JEM-2000CX透視式電子顯微鏡(TEM，日本日立儀器有限公司)。

氯化鈉、檸檬酸鈉、硼氫化鈉(美國Sigma-Aldrich公司)；氯金酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；磺胺二甲氧嘧啶(SDM，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；適體鏈GAGGGCAACGAGTGTTTATA(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 納米金顆粒的制備

取1 g HAuCl4加入100 mL水中得到1%的HAuCl4溶液后，用水進(jìn)一步稀釋得到0.01%的HAuCl4溶液，取1 g 檸檬酸鈉加入100 mL水中得到1%的檸檬酸鈉溶液，取0.075 g NaBH4加入100 mL 1%的檸檬酸鈉溶液中得到0.075%的NaBH4(溶于1%檸檬酸鈉溶液)，隨后在攪拌條件下向100 mL的0.01%HAuCl4溶液中加入1 mL 1%的檸檬酸鈉溶液，1 min后，加入1 mL 0.075%的NaBH4溶液，混合物不停攪拌直至變?yōu)榧t色。

1.3 SDM 的檢測(cè)

鹽濃度的優(yōu)化：首先將300 μL納米金溶液加入PE管中，再分別加入0、2、 4、5、10、12.5 μL濃度為2 mol/L的NaCl溶液，最后向各PE管中加水定容至500 μL(得到NaCl溶液的濃度分別為0、0.008、0.016、0.02、0.04、0.05 mol/L)，振蕩混勻后，在紫外-可見光分光光度計(jì)下掃描光譜，并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

適體鏈濃度的優(yōu)化：將300 μL納米金溶液加入PE管中，再分別加入0、5、 10、 25、50 μL濃度為10 μmol/L的適體鏈溶液(得到適體鏈的濃度為0、 0.1、0.2、0.5、1 μmol/L)，振蕩混勻，5 min后再加入10 μL 2 mol/L的NaCl溶液，最后向各PE管中加水定容至500 μL，振蕩混勻后在紫外-可見光分光光度計(jì)下測(cè)量吸收光譜。

SDM的定量檢測(cè)：將100 μmol/L適體鏈溶液稀釋至10 μmol/L，取300 μL納米金溶液于PE管中，再加入25 μL 10 μmol/L適體鏈溶液混合均勻后，分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、5 μg/mL 的SDM，混合5 min。最后向溶液中加入10 μL 2 mol/L NaCl溶液，定容至500 μL?；靹蚝蠓謩e用紫外-可見光分光光度計(jì)掃描光譜，用手機(jī)捕獲圖片，用App程序分析補(bǔ)色波長值。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)原理

圖1 納米金顆粒的TEM圖Fig.1 TEM image of nano-gold

圖 2 基于適體-納米金結(jié)構(gòu)的SDM檢測(cè)原理圖(A)及智能手機(jī)檢測(cè)SDM的手機(jī)界面(B)Fig.2 Schematic illustration of SDM detection method based on aptamer-AuNPs structure(A)and App interface of SDM detection smartphone(B)

納米金顆粒表面帶有檸檬酸根負(fù)離子，當(dāng)溶液中存在陽離子時(shí)，由于電荷平衡原理導(dǎo)致納米金聚集，溶液的顏色由紅色變成藍(lán)紫色[13，15]。據(jù)此，本文提出了基于納米金-適體鏈結(jié)構(gòu)的智能手機(jī)比色法檢測(cè)SDM，圖1為制備的納米金顆粒的TEM掃描圖，獲得納米金顆粒的直徑約10 nm。實(shí)驗(yàn)原理如圖2A所示，適體鏈可通過靜電作用吸附在納米金顆粒的表面，當(dāng)溶液中不存在SDM時(shí)，在加入NaCl溶液的情況下，包裹了適體鏈的納米金結(jié)構(gòu)避免了范德華力的作用，使得納米金顆粒無法聚集，因此溶液保持原來的紅色。當(dāng)存在SDM時(shí)，SDM特異性地與適體鏈結(jié)合，導(dǎo)致適體鏈從納米金顆粒的表面脫離，此時(shí)檸檬酸根離子裸露在溶液中，當(dāng)加入NaCl溶液時(shí)，導(dǎo)致納米金顆粒發(fā)生聚集，溶液由紅色變成藍(lán)紫色。用App程序捕獲待測(cè)溶液的圖片，根據(jù)R、G、B值與CIE色度空間的轉(zhuǎn)換對(duì)圖片補(bǔ)色波長進(jìn)行分析[16]，根據(jù)補(bǔ)色波長的大小定量檢測(cè)SDM的濃度。智能手機(jī)檢測(cè)SDM的App界面如圖2B，點(diǎn)擊Start進(jìn)入Capture界面對(duì)待測(cè)溶液進(jìn)行拍照，然后點(diǎn)擊Analyse對(duì)捕獲圖片進(jìn)行補(bǔ)色波長分析，Result界面直接給出相應(yīng)的補(bǔ)色波長和SDM濃度值，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)SDM的定量檢測(cè)。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1NaCl溶液濃度的優(yōu)化由于納米金顆粒在NaCl溶液中會(huì)發(fā)生聚集，NaCl濃度對(duì)納米金顆粒的聚集會(huì)產(chǎn)生很大的影響，因此按照“1.3”實(shí)驗(yàn)步驟優(yōu)化了NaCl溶液的濃度。結(jié)果表明，隨著NaCl濃度的逐漸增加，納米金溶液的紫外-可見光吸收光譜在最大吸收峰522 nm處的吸光度逐漸下降，表明納米金顆粒發(fā)生聚集的程度不斷增加。當(dāng)NaCl濃度增至0.04 mol/L時(shí)，522 nm處的吸光度達(dá)到穩(wěn)定，最大吸收峰的峰位發(fā)生移動(dòng)。說明此時(shí)納米金顆粒完全聚集，因此實(shí)驗(yàn)選擇NaCl溶液的最佳濃度為0.04 mol/L。

2.2.2適體鏈濃度的優(yōu)化納米金顆粒表面吸附適體鏈的濃度會(huì)直接影響檢測(cè)的靈敏度與檢測(cè)范圍，適體鏈濃度太低，會(huì)導(dǎo)致納米金顆粒過量，此時(shí)加入鹽溶液，則未與適體鏈結(jié)合的納米金會(huì)發(fā)生聚集，導(dǎo)致背景信號(hào)增大，靈敏度較低；當(dāng)適體鏈濃度過高時(shí)，適體鏈過量，此時(shí)SDM會(huì)先與過量的適體鏈結(jié)合，而不與吸附在納米金表面的適體鏈結(jié)合，使得加入鹽溶液后，納米金顆粒不產(chǎn)生聚集。因此實(shí)驗(yàn)對(duì)適體鏈濃度進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，溶液中不存在適體鏈時(shí)，加入NaCl溶液，納米金顆粒聚集，納米金溶液在522 nm處的吸光度最小，隨著適體鏈溶液濃度的增加，納米金顆粒聚集的程度逐漸減弱，最大吸收峰處的吸光度上升。當(dāng)加入0.5 μmol/L適體鏈溶液后，吸光度穩(wěn)定，說明此時(shí)納米金顆粒與適體鏈充分結(jié)合，NaCl溶液不能導(dǎo)致納米金聚集，因此選擇最佳適體鏈溶液濃度為0.5 μmol/L。

圖3 手機(jī)采集的數(shù)字圖片(A)、溶液的吸收光譜(B)以及圖片補(bǔ)色波長與SDM濃度的關(guān)系(C)Fig.3 Digital image of analyte solution(A)，UV absorption spectra of AuNPs solution(B)，relationship between comple-mentary wavelength and SDM concentrations(C)

2.3 基于智能手機(jī)的SDM補(bǔ)色波長分析

以華為麥芒4智能手機(jī)為圖片采集工具對(duì)SDM進(jìn)行檢測(cè)。由于使用智能手機(jī)對(duì)溶液進(jìn)行圖片采集，避免環(huán)境光對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響尤其重要，因此本實(shí)驗(yàn)在暗室中采用面光源垂直照射樣品，固定智能手機(jī)的拍照位置，對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行圖片的采集與分析。手機(jī)采集的數(shù)字圖片(圖3A)顯示，隨著SDM濃度的增大，待測(cè)溶液顏色逐漸向藍(lán)紫色變化，表明納米金的聚集程度逐漸增強(qiáng)；而溶液的最大吸收峰位逐漸發(fā)生紅移，表明溶液的色調(diào)隨SDM濃度的增加而發(fā)生變化。由SDM濃度與圖片補(bǔ)色波長之間的關(guān)系(圖3C)可知，隨著SDM濃度的增加，圖片補(bǔ)色波長逐漸增大，直至SDM質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)達(dá)到穩(wěn)定，因此檢測(cè)范圍為0～5 μg/mL。根據(jù)3σ原則，計(jì)算得SDM的檢出限為0.13 μg/mL。與傳統(tǒng)的檢測(cè)SDM方法[3-7]相比，該方法克服了對(duì)大型儀器的依賴，借助于智能手機(jī)圖片分析，方法更簡(jiǎn)單，更利于推廣。

3 結(jié) 論

本文通過制備納米金顆粒與適體結(jié)合的特殊結(jié)構(gòu)形式，利用智能手機(jī)數(shù)字化比色分析法實(shí)現(xiàn)了SDM的定量檢測(cè)。對(duì)鹽濃度以及適體鏈濃度進(jìn)行了優(yōu)化，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，通過手機(jī)拍照捕獲圖片，用App對(duì)圖片補(bǔ)色波長分析，實(shí)現(xiàn)了SDM的定量檢測(cè)，其檢測(cè)范圍為0～5 μg/mL，檢出限為0.13 μg/mL。本方法擺脫了傳統(tǒng)大型儀器的繁瑣檢測(cè)過程，通過利用智能手機(jī)實(shí)現(xiàn)了SDM的定量檢測(cè)。為了方便用戶，后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)檢測(cè)裝置進(jìn)行研究，以實(shí)現(xiàn)一體化和便攜式的檢測(cè)。