周 雯，戰(zhàn)麗彬,2＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 南京 210023；

2.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)脾藏象現(xiàn)代研究實(shí)驗(yàn)室 南京 210023）

輕度認(rèn)知功能障礙（Mild cognitive impairment,MCI）是由一個(gè)或多個(gè)認(rèn)知領(lǐng)域（包括記憶力，注意力，執(zhí)行功能，語言或視覺空間能力）受損而定義[1-2]，它作為癡呆的前驅(qū)階段，發(fā)展為癡呆的幾率明顯增加，最新研究表明MCI年齡大于65歲的患者隨訪2年累積癡呆發(fā)生率為14.9%[3]。一旦癡呆形成，必然給患者、家庭和社會(huì)帶來極大的痛苦和負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)有藥物在一定程度上能控制和緩解MCI癥狀，但治療效果并不理想，因此尋找高效藥物以延緩并控制MCI的發(fā)生發(fā)展具有重要的社會(huì)意義。滋補(bǔ)脾陰方藥由人參，山藥，茯苓，白芍，丹參，白扁豆，蓮子，石菖蒲，遠(yuǎn)志，檀香，陳皮，甘草12味中藥組成，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)該方可以改善學(xué)習(xí)和記憶能力，并具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[4-5]，但其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)尚未清晰闡明。

作為藥理學(xué)研究的新領(lǐng)域，整合藥理學(xué)（integrative pharmacology，IP），是研究多成分藥物與機(jī)體相互作用及其整合規(guī)律和作用原理的一門學(xué)科[6]。整合藥理學(xué)不僅可以被廣泛應(yīng)用到中藥方劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制、配伍規(guī)律等方面，以促進(jìn)中藥現(xiàn)代研究水平，而且，可以探索多成分組合藥物的研究方法，為開創(chuàng)中西醫(yī)統(tǒng)一的新醫(yī)藥學(xué)奠定基礎(chǔ)[7]。因此，利用整合藥理學(xué)平臺(tái)，探究滋補(bǔ)脾陰方藥防治輕度認(rèn)知功能障礙的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，不僅有助于解決篩選物質(zhì)基礎(chǔ)時(shí)間周期長的問題，還有助于解決探尋作用機(jī)制時(shí)單靶局限性問題，便于探究滋補(bǔ)脾陰方藥的主要活性成分群和靶標(biāo)群，闡述滋補(bǔ)脾陰方藥物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究應(yīng)用的軟件為中藥整合藥理學(xué)計(jì)算平臺(tái)（TCM-IP，www.tcmip.cn）v1.0[8]。目前有4大數(shù)據(jù)庫：中藥方劑數(shù)據(jù)庫、中藥材數(shù)據(jù)庫、中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫、疾病/癥狀靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫。該平臺(tái)由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所聯(lián)合北京大學(xué)藥學(xué)院、中國科學(xué)院相關(guān)機(jī)構(gòu)構(gòu)建。

1.2 檢索、查詢

從中藥材數(shù)據(jù)庫獲得滋補(bǔ)脾陰方藥12味中藥的名稱、拉丁名、性味歸經(jīng)、產(chǎn)地、功效及其所含化合物等信息；從中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫中獲得12味中藥的CAS號、相對分子質(zhì)量、物理化學(xué)性質(zhì)以及藥物代謝性質(zhì)等。在疾病/癥狀靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫中，以“Mild cognitive impairment”作為疾病或癥狀關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得治療“Mild cognitive impairment”的藥物名稱、藥物療效、藥物靶標(biāo)的基因和蛋白質(zhì)相關(guān)信息。

1.3 靶標(biāo)預(yù)測和共性靶標(biāo)分析

采用二維結(jié)構(gòu)相似性搜索（即MACCS分子指紋），采用開源軟件OpenBabel提取化學(xué)指紋特征，使用Tanimoto系數(shù)定義的相似度計(jì)量方法，與FDA上市藥物進(jìn)行相似性打分（Score≥0.8），獲得滋補(bǔ)脾陰方藥作用的潛在靶標(biāo)，建立藥物候選靶標(biāo)信息數(shù)據(jù)庫。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析、可視化

基于滋補(bǔ)脾陰方藥藥物靶標(biāo)與MCI之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，建立滋補(bǔ)脾陰方藥靶標(biāo)-MCI基因互作網(wǎng)絡(luò)；以“節(jié)點(diǎn)連接度（degree）”的2倍中位數(shù)為卡值，選取滋補(bǔ)脾陰方藥靶標(biāo)-輕度認(rèn)知功能障礙基因互作網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)（hubs）；在構(gòu)建關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)子網(wǎng)的基礎(chǔ)上，以“degree”、“節(jié)點(diǎn)緊密度（closeness）”和“節(jié)點(diǎn)介度（betweenness）”的中位數(shù)為卡值，選取同時(shí)滿足3個(gè)卡值的節(jié)點(diǎn)為滋補(bǔ)脾陰方藥治療MCI失衡網(wǎng)絡(luò)的候選靶標(biāo)；然后，通過對上述滋補(bǔ)脾陰方藥候選靶標(biāo)參與的功能與通路進(jìn)行富集分析，進(jìn)一步挖掘滋補(bǔ)脾陰方藥緩解MCI關(guān)鍵病理的分子機(jī)制，構(gòu)建“滋補(bǔ)脾陰方藥-中藥材-化學(xué)成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”的多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖。

1.5 基因功能分析與通路分析

基于基因本體數(shù)據(jù)庫（gene ontology，GO）和KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）通路數(shù)據(jù)庫，提取滋補(bǔ)脾陰方藥靶標(biāo)的分子功能（molecular function）、細(xì)胞內(nèi)定位（subcellular localization），及其所參與的生物學(xué)反應(yīng)（biological process）和通路（pathway），進(jìn)行富集計(jì)算。針對滋補(bǔ)脾陰方藥直接作用靶標(biāo)及其治療MCI的核心靶標(biāo)，進(jìn)行基因功能分析與通路分析。

表1 “中藥-成分-靶標(biāo)”基本信息

2 結(jié)果

2.1 滋補(bǔ)脾陰方藥靶標(biāo)預(yù)測和共性靶標(biāo)分析

通過篩選，得到滋補(bǔ)脾陰方藥成分687種，其中人參的成分?jǐn)?shù)量最多有158種，蓮子的成分?jǐn)?shù)量最少僅10種，成分?jǐn)?shù)目及靶標(biāo)總數(shù)目見表1。共性靶標(biāo)分析顯示，滋補(bǔ)脾陰方藥中12味中藥之間存在協(xié)同作用，其中人參、山藥、白芍、白扁豆等藥物間共性靶標(biāo)較多，說明這幾味中藥協(xié)同作用較強(qiáng)。共性靶標(biāo)分析結(jié)果見表2。

2.2 滋補(bǔ)脾陰方藥治療MCI的候選靶標(biāo)基因互作網(wǎng)絡(luò)分析

以節(jié)點(diǎn)連接度的2倍中位數(shù)為卡值，構(gòu)建滋補(bǔ)脾陰方藥靶標(biāo)-MCI基因互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)子網(wǎng)見圖1；以節(jié)點(diǎn)連接度、節(jié)點(diǎn)緊密度和節(jié)點(diǎn)介度的中位數(shù)為卡值，選取滋補(bǔ)脾陰方藥治療MCI網(wǎng)絡(luò)的候選靶標(biāo)，共計(jì)595個(gè)，排名前10見表3，關(guān)鍵靶標(biāo)對應(yīng)的化合物及中藥來源顯示在表4中，并構(gòu)建“滋補(bǔ)脾陰方藥-中藥材-化學(xué)成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”的多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖，見圖2。

2.3 滋補(bǔ)脾陰方藥治療MCI的關(guān)鍵靶標(biāo)富集分析

2.3.1 關(guān)鍵靶標(biāo)的GO富集分析

對滋補(bǔ)脾陰方藥直接作用靶標(biāo)及其治療MCI的核心靶標(biāo)進(jìn)行基因功能分析，根據(jù)P值排名前10位展示在表5中。

表2 滋補(bǔ)脾陰方藥中單味藥材間共有靶標(biāo)分析結(jié)果

圖1 滋補(bǔ)脾陰方藥靶標(biāo)-MCI基因互作網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)子網(wǎng)

2.3.2 關(guān)鍵靶標(biāo)的KEGG通路富集分析

對滋補(bǔ)脾陰方藥直接作用靶標(biāo)及其治療MCI的核心靶標(biāo)進(jìn)行通路分析，總共獲得190條通路，根據(jù)P值排名前10位展示在表6中。

3 討論

滋補(bǔ)脾陰方藥是戰(zhàn)麗彬教授在多年臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上，根據(jù)清代·吳澄《不居集》中資成湯化裁而成，由人參，山藥，茯苓，白芍等藥物組成。全方共奏培補(bǔ)后天、滋補(bǔ)脾陰、活血化痰、安神益智之效。通過對計(jì)算得到的滋補(bǔ)脾陰方藥與輕度認(rèn)知功能障礙的相關(guān)有效物質(zhì)進(jìn)行文獻(xiàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)人參中的人參皂苷Rb1[9]、Rh1[10]、Rg3[11]、Rg1[12]，白芍中的芍藥苷[13]，丹參中的丹參酮[14]、丹參多酚酸[15]，茯苓中的茯苓多糖[16]，遠(yuǎn)志中的遠(yuǎn)志皂苷[17]等均有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，證明了此研究方法的合理性。共性靶標(biāo)分析顯示，共靶數(shù)目較多的有人參-山藥290個(gè)，人參-白芍103個(gè)，人參-白扁豆113個(gè)，人參-甘草110個(gè)，人參-遠(yuǎn)志72個(gè)，人參-丹參68個(gè)，白扁豆-山藥109個(gè)，說明這些藥物之間協(xié)同作用較強(qiáng)。而陳皮、檀香、石菖蒲、蓮子與其他藥物之間的共靶數(shù)目較少，說明這些藥物協(xié)同作用較弱，提示滋補(bǔ)脾陰方藥中治療MCI的核心藥物可能是人參、山藥、茯苓、白扁豆、白芍、丹參、遠(yuǎn)志和甘草。

表3 滋補(bǔ)脾陰方藥治療MCI的候選靶標(biāo)名稱及其相關(guān)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鲄?shù)值

表4 滋補(bǔ)脾陰方藥治療MCI關(guān)鍵靶標(biāo)對應(yīng)的化合物、中藥來源及所參與主要信號通路

圖2 “滋補(bǔ)脾陰方藥-中藥材-化學(xué)成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)

表5 滋補(bǔ)脾陰方藥治療MCI關(guān)鍵靶標(biāo)GO富集分析結(jié)果

通過網(wǎng)絡(luò)分析，滋補(bǔ)脾陰方藥治療MCI排在前10位的關(guān)鍵靶標(biāo)有HADHA（羥酰輔酶A脫氫酶三功能多酶復(fù)合物亞基α）、HADH（羥酰-CoA脫氫酶）、NSDHL（NAD（P）依賴類固醇脫氫酶樣）、PLCD1（1-磷脂酰肌醇4,5-二磷酸磷酸二酯酶δ-1）、ADH1A（乙醇脫氫酶1A）、ALDH3A2（脂肪醛脫氫酶）、GCK（葡萄糖激酶）、ADH1C（乙醇脫氫酶1C）、ENPP1（核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員1）、ADCY2（腺苷酸環(huán)化酶2型）。這些關(guān)鍵靶標(biāo)主要來源于人參中的三磷酸腺苷、甘露糖、蔗糖、木糖、果糖、甘露糖、甘露糖-b、麥芽糖、腺苷，山藥中的植酸、D-甘露糖、D-葡萄糖苷、木糖、半乳糖、3,4,6-Trihydroxyphenanthrene-3-O-β-d-D-吡喃葡萄糖苷，白芍中的1-O-沒食子?；?葡萄糖，遠(yuǎn)志中的遠(yuǎn)志糖醇，白扁豆中的水蘇糖、麥芽糖、蔗糖，甘草中的異甘草甙、新異甘草甙、甘草酸、甘草皂苷B2、甘草皂苷C2、甘草皂苷D3、甘草皂苷H2、烏拉爾甘草皂甙A、烏拉爾甘草皂甙B，并且可能在滋補(bǔ)脾陰方藥防治MCI中發(fā)揮重要作用。通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，這些關(guān)鍵靶標(biāo)主要定位于細(xì)胞質(zhì)、線粒體等，常見的分子功能是ATP結(jié)合、蛋白結(jié)合等，并參與調(diào)控三羧酸循環(huán)等過程。KEGG通路分析顯示這些關(guān)鍵靶標(biāo)參與嘌呤代謝、核苷酸代謝、碳代謝、碳水化合物代謝等通路。嘌呤代謝通路中的代謝產(chǎn)物尿酸水平與認(rèn)知障礙密切相關(guān)[18]。神經(jīng)退行性疾病中存在核苷酸代謝障礙[19]。碳代謝中的葉酸和維生素B12通過參與機(jī)體細(xì)胞生物甲基化和DNA的合成，以及機(jī)體奇數(shù)鏈脂肪酸和某些氨基酸的線粒體代謝過程，對神經(jīng)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。若代謝過程受到干擾，就會(huì)對機(jī)體神經(jīng)組織造成一定的影響[20]。碳水核苷酸代謝的紊亂化合物是生命細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要成分及主要供能物質(zhì)，并且有調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)的重要功能。機(jī)體中碳水化合物的存在形式主要有三種，葡萄糖、糖原和含糖的復(fù)合物。葡萄糖是大腦重要的能量物質(zhì)，大腦葡萄糖代謝障礙與認(rèn)知障礙密切相關(guān)[21]。上述分析結(jié)果與已知文獻(xiàn)報(bào)道有一定的吻合，說明了TCMIP預(yù)測的準(zhǔn)確性，為進(jìn)一步深入闡釋滋補(bǔ)脾陰方藥的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

表6 滋補(bǔ)脾陰方藥治療MCI關(guān)鍵靶標(biāo)KEGG富集分析結(jié)果

綜上所述，本研究利用整合藥理學(xué)平臺(tái)，以中醫(yī)藥大數(shù)據(jù)為支撐，采用人工智能“數(shù)據(jù)挖掘”網(wǎng)絡(luò)科學(xué)等學(xué)科的方法與技術(shù)，多靶點(diǎn)、多方位、多層次地對滋補(bǔ)脾陰方藥的活性成分、藥物靶點(diǎn)和MCI信號通路進(jìn)行了探索性研究。研究結(jié)果初步驗(yàn)證了滋補(bǔ)脾陰方藥防治MCI的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，既體現(xiàn)了滋補(bǔ)脾陰方藥多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)，也為進(jìn)一步深入探討作用機(jī)制奠定了良好基礎(chǔ)。整合藥理學(xué)平臺(tái)作為一種新興的中藥現(xiàn)代研究手段，還存在一定的局限性，若要將得出的結(jié)論應(yīng)用于臨床，仍需體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。同時(shí)，本研究未考慮中藥的劑量以及煎煮過程中活性成分的變化，因此還需要進(jìn)一步深入研究探討。