陳建權(quán)，張夢(mèng)恬，熊 意，張向前，張 堯，王愛(ài)英，祝建波

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

ICE(inducer of CBF expression)是低溫脅迫轉(zhuǎn)錄激活因子，在低溫脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)和誘導(dǎo)下游冷誘導(dǎo)基因(COR)的表達(dá)中起著關(guān)鍵的作用，是近年植物抗寒基因工程中研究較多的一類轉(zhuǎn)錄因子。2003年，朱健康[1]實(shí)驗(yàn)室利用EMS誘變含有ProCBF3:LUC的擬南芥(Arabidopsisthaliana)轉(zhuǎn)基因植株，獲得了ICE1突變體，并成功克隆到ICE1基因。隨后研究者相繼發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中ICE1和ICE2基因可以編碼MYC型bHLH轉(zhuǎn)錄因子，控制植物對(duì)低溫的反應(yīng)，是植物低溫脅迫反應(yīng)的正調(diào)控因子[2]，在常溫條件下，ICE1蛋白處于未激活狀態(tài)，低溫下被激活，特異性地結(jié)合到CBF啟動(dòng)子的順式作用元件上，通過(guò)調(diào)節(jié)CBF/DREB1參與冷應(yīng)激反應(yīng)[3]。ICE2基因與ICE1具有高度相似性，最近有研究發(fā)現(xiàn)，ICE2的過(guò)度表達(dá)可以激活CBF1基因的表達(dá)，后者又激活COR/RD/LTI基因的冷依賴和ABA非依賴性表達(dá)[4]；JAZ蛋白是茉莉酸信號(hào)的抑制因子，它可以通過(guò)與ICE2蛋白的直接結(jié)合來(lái)抑制ICE2基因的轉(zhuǎn)錄功能[5]；2007年P(guān)illitteri等[6]研究發(fā)現(xiàn)，ICE2基因在氣孔形成的過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究克隆了天山雪蓮SiICE2基因，以pCAMBIA2300載體為骨架構(gòu)建了植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法侵染番茄(Lycopersiconesculentum)，成功獲得轉(zhuǎn)天山雪蓮SiICE2基因番茄植株，將轉(zhuǎn)天山雪蓮SiICE2基因和野生型番茄分別在0 ℃處理不同時(shí)間，測(cè)量各株系相對(duì)電導(dǎo)率及相關(guān)酶活性變化，再觀察各株系表型恢復(fù)狀態(tài)，初步探究了天山雪蓮SiICE2基因在番茄抵抗低溫環(huán)境下的作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究所用的天山雪蓮野生型(Saussureainvolucrata)和番茄(Lycopersiconesculentum)野生型(WT)由新疆石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方 法

1.2.1天山雪蓮SiICE2基因的克隆本研究通過(guò)對(duì)天山雪蓮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析得到SiICE2基因序列，利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物SiICE2-Up和SiICE2-Down(表1)，反應(yīng)程序如下：94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min, 25個(gè)循環(huán); 72 ℃ 延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)正確后，回收目的片段連接于pGM-T載體，得到重組載體pGM-SiICE2，酶切鑒定正確后測(cè)序。利用DNAMAN軟件分析測(cè)序正確的序列，確定ORF并推導(dǎo)相應(yīng)氨基酸序列。

1.2.2植物表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶SmaI和SalI雙酶切重組載體pGM-SiICE2和植物表達(dá)載體pCAMBIA2300, 將目的基因片段和載體片段連接，得到重組載體pCAMBIA2300-35S-SiICE2-Nos，運(yùn)用熱激法將重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中；運(yùn)用電擊法將重組子導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV1301。

1.2.3轉(zhuǎn)SiICE2基因番茄的獲得及分子鑒定取番茄葉片剪成小塊，暗培養(yǎng)2 d，將葉片夾入已活化好的含pCAMBIA2300-35S-SiICE2-Nos質(zhì)粒的農(nóng)桿菌箘液中，振蕩侵染15 min；取出葉片，用無(wú)菌濾紙吸干，葉片正面朝上平鋪于MS培養(yǎng)基(含濾紙)上；暗培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)入含50 mg/L Cb和100 mg/L Kan分化培養(yǎng)基中；室溫光照培養(yǎng)待不定芽的分化，每隔15 d更換1次培養(yǎng)基；25～35 d以后，葉片邊緣的愈傷組織逐漸分化出叢生芽；待叢生芽長(zhǎng)至2～3 cm左右，轉(zhuǎn)接至MS+50 mg/L Kan+0.3 mg/L IAA+500 mg/L Cb的番茄生根培養(yǎng)基中，繼續(xù)生根培養(yǎng)。20 d后，將根系生長(zhǎng)良好的轉(zhuǎn)化植株移栽至基質(zhì)(蛭石∶腐質(zhì)土=2∶1)中，在培養(yǎng)室內(nèi)以25 ℃、45%～60%濕度、每天光照9 h的條件下培養(yǎng)。利用CTAB法[7]提取轉(zhuǎn)化番茄和野生型番茄葉片DNA，以野生型番茄DNA為陰性對(duì)照，質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)轉(zhuǎn)化番茄進(jìn)行PCR檢測(cè)。利用Trizol法提取轉(zhuǎn)化和野生型番茄RNA[8]，用cDNA試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA第一鏈。根據(jù)番茄GAPDH基因、天山雪蓮SiICE2基因序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，以得到的第一鏈為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下: 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退30 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 本研究所用引物

1.2.4SiICE2表達(dá)量及生理指標(biāo)測(cè)定選取長(zhǎng)勢(shì)良好的轉(zhuǎn)SiICE2基因番茄3株(G1、G2、G3)和野生型(WT)一起置于0 ℃處理2、4、8、12、24 h，通過(guò)qRT-PCR測(cè)定SiICE2基因的表達(dá)量；測(cè)定各株系相對(duì)電導(dǎo)率[9-12]、丙二醛含量[13-14]、過(guò)氧化物酶(POD)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性[15-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiICE2基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以天山雪蓮cDNA為模板進(jìn)行SiICE2基因的克隆，經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切鑒定，證明天山雪蓮SiICE2基因克隆成功(圖1)。經(jīng)DNAMAN軟件分析，發(fā)現(xiàn)SiICE2基因序列的最大開(kāi)放閱讀框?yàn)?62 bp，共編碼153個(gè)氨基酸(圖2)。利用Blastp對(duì)該蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該片段含有ACT(super family)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用Protparam預(yù)測(cè)天山雪蓮SiICE2蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示：分子式為C750H1217N209O244S4，相對(duì)分子量為17 194.41 Da，等電點(diǎn)為5.17，屬于堿性蛋白；理論推導(dǎo)半衰期大約為30 h，不穩(wěn)定參數(shù)為40.25；蛋白中Glu、Leu、Lys和Ser的相對(duì)含量較高；帶負(fù)電荷的殘基為56，帶正電荷的殘基為40；脂肪族氨基酸指數(shù)為94.31，平均疏水指數(shù)為-0.489。利用Blast分析和Mega軟件構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示SiICE2與菜薊的親緣關(guān)系最近(圖3)。

M. DNA Maker Ⅲ；A. pGM-SiICE2載體PCR鑒定: 1～2. PCR產(chǎn)物; 3. 陽(yáng)性對(duì)照; 4. 陰性對(duì)照；B. pGM-SiICE2載體酶切鑒定: 1～2. SiICE2; 3. 質(zhì)粒對(duì)照?qǐng)D1 天山雪蓮SiICE2基因的克隆M. DNA Maker Ⅲ; A. PCR identification of pGM-SiICE2: 1-2. PCR products; 3. Plasmid control; 4. Negative control;B. Restriction enzyme digestion of pGM-SiICE2 plasmid: 1-2. SiICE2; 3. PlasmidFig.1 Cloning of Saussurea involucrata SiICE2 gene

圖3 天山雪蓮SiICE2蛋白與其他植物ICE2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree analysis of S. involucrata SiICE2 and ICE2s of other plants

圖2 天山雪蓮SiICE2基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide and putative amino acid sequences of S. involucrata SiICE2 gene

2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)SiICE2基因番茄的獲得

用限制性內(nèi)切酶SmaI和SalI雙酶切重組載體pGM-SiICE2和植物表達(dá)載體pCAMBIA2300，將目的基因片段和載體片段連接，運(yùn)用熱激法將得到的重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，用SmaI和SalI雙酶切鑒定，證明植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-SiICE2-Nos構(gòu)建成功(圖4)。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染番茄，得到轉(zhuǎn)化的番茄植株(圖5)。取9株轉(zhuǎn)化的番茄植株葉片各0.2 g，提取基因組DNA，并以其為模板對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，均得到462 bp特異條帶(圖6)。進(jìn)一步采用Trizol法提取轉(zhuǎn)化番茄和野生型番茄RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果(圖7)表明，天山雪蓮SiICE2基因已成功轉(zhuǎn)化到9株番茄中。

M. DNA marker Ⅲ; 1. 質(zhì)粒對(duì)照; 2. 雙酶切產(chǎn)物圖4 pCAMBIA2300-35S-SiICE2-Nos載體的酶切鑒定M. DNA marker Ⅲ; 1. Plasmid; 2. Double digestion productFig.4 Restriction enzyme digestion of pCAMBIA2300-35S-SiICE2-Nos plasmid

2.3 轉(zhuǎn)SiICE2基因番茄對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)

2.3.1SiICE2基因在番茄表達(dá)量的變化選取長(zhǎng)勢(shì)良好的轉(zhuǎn)SiICE2基因番茄3株(G1、G2、G3)置于0 ℃處理2、4、8、12、24 h，20 ℃恢復(fù)2 d。通過(guò)qRT-PCR測(cè)定SiICE2基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果(圖8)表明，相同株系在不同的低溫處理時(shí)間內(nèi)，SiICE2基因的表達(dá)量變化差異不大；不同株系之間，SiICE2基因的表達(dá)量變化存在一些差異。

2.3.2葉片形態(tài)變化由圖9可以看出野生型番茄在0 ℃處理2 h時(shí)，葉片出現(xiàn)少量壞死斑，4 h時(shí)葉片邊緣失水萎蔫，8 h時(shí)失水更為嚴(yán)重且有凍僵的觸感，12 h時(shí)植株頂端的葉片完全凍僵，其他的葉片出現(xiàn)黃色枯斑，24 h時(shí)大部分葉片已凍僵且出現(xiàn)大量明顯枯斑；而轉(zhuǎn)SiICE2基因番茄在0 ℃各處理時(shí)間葉片也出現(xiàn)了部分失水萎蔫、黃色枯斑的現(xiàn)象，但較野生型有顯著的好轉(zhuǎn)，經(jīng)過(guò)5 d的恢復(fù)實(shí)驗(yàn)后，野生型整棵植株基本干枯，無(wú)法恢復(fù)到低溫脅迫處理前的狀態(tài)，轉(zhuǎn)SiICE2基因植株基本恢復(fù)。表明天山雪蓮SiICE2基因可提高番茄抗寒性。

A. 番茄無(wú)菌苗的種植; B. 子葉預(yù)培養(yǎng); C. 誘導(dǎo)再生芽; D. 誘導(dǎo)生根; E. 移栽; F. 開(kāi)花結(jié)果圖5 轉(zhuǎn)SiICE2基因番茄的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程A. Aseptic seedling; B. Cotyledon preincubation; C. Bud induction; D. Rooting induction; E. Smelting plants; F. Blossom and bear fruitFig.5 Process of transforming SiICE2 gene in Lycopersicon esculentum

M. DNA marker Ⅲ; 1～9. 轉(zhuǎn)SiICE2基因番茄植株; 10. 陰性對(duì)照; 11. 陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D6 轉(zhuǎn)SiICE2基因番茄的PCR鑒定M. DNA marker Ⅲ; 1-9. Transfer SiICE2 of Lycopersicon esculentum lines; 10. Negative control; 11. Positive controlFig.6 Transfer SiICE2 of Lycopersicon esculentum PCR amplification

2.3.3膜穩(wěn)定性的變化由圖10可以看出，隨著0 ℃處理時(shí)間的增加，各株系相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛(MDA)均會(huì)隨著處理時(shí)間的增加而升高，但是轉(zhuǎn)SiICE2基因植株在各處理時(shí)間段內(nèi)的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量均顯著低于野生型；在處理24 h時(shí)，野生型的相對(duì)電導(dǎo)率達(dá)到了75.4%，而轉(zhuǎn)SiICE2基因型番茄平均只有43.7%，相比野生型低31.7%(圖10，A)；在處理24 h時(shí)，野生型MDA含量達(dá)到了12.3 μmol/g，而轉(zhuǎn)SiICE2基因型番茄平均只有8.1 μmol/g，相比野生型低4.2 μmol/g。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)SiICE2基因的番茄相比野生型，可以更好地抑制植株相對(duì)電導(dǎo)率的升高和丙二醛含量的增加，從而緩解低溫環(huán)境對(duì)植株生物膜的損害。

A. 目的基因(1～9. 轉(zhuǎn)SiICE2基因番茄植株); B. 內(nèi)參基因(1～9. GAPDH基因)圖7 轉(zhuǎn)SiICE2基因番茄的RT-PCR鑒定A. Target gene(1-9. Transfer SiICE2 of Lycopersicon esculentum); B. Reference genes(1-9. GAPDH)Fig.7 Transfer SiICE2 of Lycopersicon esculentum RT-PCR amplification

2.3.4抗氧化能力由圖11得出，各材料POD和CAT活性在0 ℃處理前并無(wú)顯著差異。0 ℃處理2～24 h期間，轉(zhuǎn)SiICE2基因型番茄POD、CAT和SOD活性持續(xù)上升，野生型先逐漸升高后降低，并在12 h達(dá)到最大值。在12 h時(shí)，轉(zhuǎn)SiICE2基因型POD活性的平均值相比野生型高33.3%；CAT活性的平均值相比野生型高32.7%；3株轉(zhuǎn)SiICE2基因型的SOD活性分別為150(G1)、135(G2)、141(G3) μmol·g-1· min-1，野生型酶活性為108 μmol·g-1· min-1，轉(zhuǎn)SiICE2基因型植株顯著高于野生型植株。在生長(zhǎng)恢復(fù)實(shí)驗(yàn)后，轉(zhuǎn)SiICE2基因型POD、CAT和SOD活性基本恢復(fù)到了未處理前水平，而野生型未恢復(fù)。以上結(jié)果表明，低溫處理下SiICE2基因可以提高番茄植株抗氧化酶的活性，從而減輕低溫引起的細(xì)胞膜質(zhì)氧化造成的損傷，增強(qiáng)了植株的低溫耐受能力。

G1, G2, G3. 轉(zhuǎn)SiICE2基因番茄；recover.20 ℃恢復(fù)處理2 d。下同圖8 低溫處理下轉(zhuǎn)基因番茄SiICE2的相對(duì)表達(dá)量G1, G2, G3. Transgenic SiICE2 gene Lycopersicon esculentum；recover. Recovered for 2 days under 20 ℃; The same as belowFig.8 The relative expression of SiICE2 gene under low temperature stress

圖9 不同低溫處理時(shí)間下各株系番茄葉片的變化Fig.9 Changes of Lycopersicon esculentum leaves in different strains under different low temperature time

*表示同期轉(zhuǎn)基因株系與野生型間在0.05水平存在顯著性差異；下同圖10 低溫處理下各株系番茄膜生理指標(biāo)的變化* stand for the significant difference between transgenic line and wild type within the same stage at 0.05 level. The same as belowFig.10 Changes of physiological indexes of Lycopersicon esculentum membrane under low temperature treatments

圖11 低溫處理下各株系番茄抗氧化酶活性的變化Fig.11 Changes of antioxidant enzyme activities of Lycopersicon esculentum under low temperature treatments

3 討 論

低溫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因素之一，其危害一方面是損害了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和膜上的酶系統(tǒng)，從而干擾細(xì)胞代謝過(guò)程，使有毒物質(zhì)積累，進(jìn)而引發(fā)代謝失調(diào)[19]；另一方面是使體內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生與過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)等保護(hù)酶系統(tǒng)失去動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致活性氧的累積，造成氧化傷害，并影響植株正常的生長(zhǎng)和發(fā)育[20-21]。ICE2是ICE1的同源基因，通過(guò)CBF1/CBF3的表達(dá)正調(diào)控植物對(duì)低溫的響應(yīng)，但I(xiàn)CE2與ICE1同樣具有差別，Kurbidaeva等[22]研究發(fā)現(xiàn)ICE2和ICE1蛋白分別由450和494個(gè)氨基酸組成，其中有190個(gè)氨基酸區(qū)域?yàn)楦弑Ｊ貐^(qū)域，均由疏水性氨基酸組成，ICE1由不帶電荷的氨基酸組成，而ICE2由帶負(fù)電荷的氨基酸組成，同時(shí)Kurbidaeva還發(fā)現(xiàn)ICE2相比ICE1含有較多的谷氨酰胺和亮氨酸以及磷酸化位點(diǎn)，且這些蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度較短，推測(cè)ICE2蛋白的活性受到嚴(yán)格的調(diào)控。Oksana等[23]發(fā)現(xiàn)ICE2由5個(gè)外顯子構(gòu)成，第1個(gè)外顯子可以編碼F-box結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?yàn)橹参锾禺愋缘鞍?，?和第3外顯子含有bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域，這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族在整個(gè)細(xì)胞周期中都有重要作用，同時(shí)在植物受到低溫刺激后ICE2轉(zhuǎn)錄因子并不是通過(guò)泛素依賴性蛋白水解途徑響應(yīng)，而是直接參與冷應(yīng)激反應(yīng)。

本研究運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-SiICE2-Nos導(dǎo)入番茄，通過(guò)對(duì)低溫處理下轉(zhuǎn)天山雪蓮SiICE2基因型和野生型番茄的葉片形態(tài)變化和丙二醛含量、相對(duì)電導(dǎo)率、POD、CAT和SOD的活性分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)天山雪蓮SiICE2基因的番茄在低溫處理下，相比野生型植株可以更好地提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而提高植株抗寒性。

ICE1基因在擬南芥、小麥[24]和甜楊[25]中是組成型表達(dá)，但芥菜ICE1 (Cbice53)[26]的表達(dá)水平會(huì)受到低溫脅迫和鹽脅迫誘導(dǎo)而提高。ICE2是ICE1的同源基因但是目前研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)不同溫度處理下，在同一轉(zhuǎn)基因番茄株系中SiICE2基因的表達(dá)量變化很小，SiICE2基因是否與擬南芥等植物ICE1一樣，是組成型表達(dá)，仍有待于進(jìn)一步研究。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)0 ℃處理前(0 h)，轉(zhuǎn)SiICE2基因番茄的MDA量及POD 、CAT和SOD活性與野生型植株基本相同，這是否說(shuō)明SiICE2基因在常溫下是鈍化的，對(duì)植株的生理生化代謝是否有影響，還需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果初步反映了天山雪蓮SiICE2基因具有一定的抗寒性，這為今后進(jìn)一步研究該基因以及天山雪蓮物種資源的開(kāi)發(fā)和利用提供了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。