李培謙，馮寶珍

(運(yùn)城學(xué)院，山西 運(yùn)城 044000)

灰霉菌(Botrytiscinerea)能夠引起大田作物，水果蔬菜及園林花卉等1000多種植物的病害，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。當(dāng)前，灰霉病的防治是以化學(xué)防治為主。但是灰霉菌適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖快，易突變，很快對多種藥劑產(chǎn)生抗藥性，如：多菌靈、腐霉利、乙霉威等[2～3]。

啶酰菌胺屬于琥珀酸脫氫酶抑制劑 (succinate dehydrogenase inhibitors) 類殺菌劑，由德國巴斯夫公司開發(fā)，可用于防治灰霉病菌核病銹病白粉病等[4]。自2006年開始在我國登記用于防治蔬菜灰霉病[5]。其作為新穎吡啶類殺菌劑，具有活性高、作用機(jī)理獨(dú)特、殺菌譜較廣、不易產(chǎn)生交互抗性、對作物安全等特點(diǎn)。然而，隨著該藥劑的推廣使用，已有報(bào)道顯示在部分地區(qū)有些作物上出現(xiàn)了抗性。余玲等[6]報(bào)道山西部分地市保護(hù)地蔬菜對啶酰菌胺產(chǎn)生了抗藥性。石延霞等[3]發(fā)現(xiàn)我國主要蔬菜種植區(qū)的灰葡萄孢的抗性頻率高達(dá)41%以上，并且高抗菌株占62%以上。這都表明灰葡萄孢對啶酰菌胺的抗性發(fā)展迅速，需要加強(qiáng)田間用藥指導(dǎo)，規(guī)范合理用藥。

植物病原菌出現(xiàn)抗藥性，其生理生化特性也會發(fā)生改變。新型殺菌劑SYP-1620引起灰葡萄孢抗性菌株菌絲生長速率減慢，致病力下降但是沒有引起菌絲干重變化[7]。氟啶胺引起灰葡萄孢呼吸速率下降及ATP酶活性升高等方面生理特征改變[8]。目前關(guān)于見關(guān)于番茄灰霉菌抗啶酰菌胺菌株生理生化特性方面的報(bào)道尚少，而該特性對探明菌株的抗藥性機(jī)理及進(jìn)行抗性風(fēng)險(xiǎn)評估具有重要意義。本研究以番茄灰霉菌敏感菌株和抗性菌株為研究對象，比較分析這兩種類型菌株在苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、適應(yīng)性評價(jià)及致病力等生理生化特性差異，以期為闡明病原菌的的抗藥性機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試60個番茄灰霉菌株于2012-2016采于山東濰坊、泰安、濟(jì)南，河南三門峽以及山西運(yùn)城等地的番茄種植保護(hù)地。采用單孢分離法獲得菌株，在PDA斜面培養(yǎng)5～7天，然后置于4 ℃冰箱保存。敏感性菌株采自未使用過啶酰菌胺的番茄植株。

1.2 供試藥劑

試驗(yàn)所用啶酰菌胺(boscalid)水分散粒劑(96%)，由上海源葉生物科技有限公司提供。96%丙酮(分析純)，由萊陽市康德化工有限公司生產(chǎn)。

1.3 番茄灰霉菌抗性水平測定

參照前人研究，利用菌絲生長速率法測定番茄灰霉菌對啶酰菌胺的敏感性[9]。

1.3.1 含藥培養(yǎng)基制備

稱取濃度為96%的啶酰菌胺原藥166.67 mg，溶解于5 mL的丙酮溶液中，再加入少量乳化劑(吐溫80)，使其溶解更充分，最終制得濃度為32 g·L-1的啶酰菌胺母液。在無菌操作臺上，用移液槍取一定量的啶酰菌胺藥液于含有50 mL PDA培養(yǎng)基的錐形瓶中，再用移液槍吸打，使其與培養(yǎng)基充分混勻，乘熱，倒入培養(yǎng)皿中，制備含藥培養(yǎng)基。按上述方法，制備含藥培養(yǎng)基終濃度分別為0(CK)、5、10、20、30 μg·mL-1。

1.3.2 抗性水平測定

然后將直徑5 mm菌餅接種于上述培養(yǎng)基內(nèi)，而后置于22 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5天左右，等到培養(yǎng)皿內(nèi)菌絲生長到大約培養(yǎng)皿大小的四分之三時(shí)，測量其菌落直徑。利用十字交叉法分別測量每個培養(yǎng)皿中的菌落直徑，如果遇到橢圓形的或者形狀不規(guī)則的要分別測量它們的最短直徑和最長的直徑，然后分別求其平均值，利用DPS軟件分別求其菌絲生長抑制率及試驗(yàn)菌株的EC50值。啶酰菌胺抗藥性水平標(biāo)準(zhǔn)參照Veloukas等[10]的方法。

1.4 酶活性分析

1.4.1 菌絲制備

選取抗性菌株R1和敏感菌株S1進(jìn)行PAL和POD酶活性分析。先將這兩個菌株在PDA培養(yǎng)基上于22 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，于菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅。分別接入含有質(zhì)量濃度為1.0、5.0、25.0μg·mL-1的啶酰菌胺的PDA液體培養(yǎng)基中，每瓶接入20塊菌餅，然后于22 ℃恒溫、120 r·min-1下分別振蕩培養(yǎng)。并于0、1.5、6和24 h取樣。菌絲體經(jīng)四層紗布過濾，再用無菌水沖洗3次，吸水紙吸干水分后，放在-80 ℃?zhèn)溆?。?.1 μg·mL-1丙酮溶劑稀釋液為對照，每個處理重復(fù)3次。

1.4.2 PAL活性分析

稱取1 g樣品，液氮研磨后轉(zhuǎn)移至2 mL 離心管，加入無菌水制備粗酶液。參照前人研究方法[11]，分別配制反應(yīng)液：pH 8.7硼酸緩沖液和0.02 mol·L-1的L-苯丙氨酸溶液。試管中分別加入2.0 mL硼酸緩沖液、1 mL L-苯丙氨酸以及0.5 mL粗酶液，然后置于40 ℃水浴中反應(yīng)60 min，后用0.5 mL 6 mol·L-1的鹽酸終止反應(yīng)。對照用0.5 mL硼酸緩沖液代替粗酶液。用紫外分光光度計(jì)測定290 nm處吸光度A290的變化。以每1 min內(nèi)A290變化0.01為1個酶活力單位(μmol·min-1)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 POD活性分析

根據(jù)付麗等[12]的研究方法采用愈創(chuàng)木酚法，并略加改進(jìn)。反應(yīng)體系為: pH 5.8磷酸緩沖液2.0 mL，3% H2O21 mL，0.05 mol·L-11 mL、粗酶液1.0 mL。37 ℃水浴，反應(yīng)15 min后迅速轉(zhuǎn)入冰浴中，對照以磷酸緩沖液代替酶液。用紫外分光光度計(jì)在470 nm處測定反應(yīng)3 min時(shí)的吸光度(A)。每隔30 s記錄1次，共記6次，以每1 min內(nèi)A470變化0.01為1個酶活力單位(μmol·min-1)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 適應(yīng)性評價(jià)

1.5.1 菌絲生長速率測定

采用生長速率法對抗性菌株與敏感性菌株的生長情況進(jìn)行了比較[13]。取直徑5 mm的菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上于22 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，然后十字交叉法測定菌落直徑大小。每個菌株做四個平板，試驗(yàn)重復(fù)兩次。

1.5.2 產(chǎn)孢量測定

取直徑5 mm的菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上于22 ℃黑暗培養(yǎng)12 d，然后加入5 mL無菌水，兩層紗布過濾后得到分生孢子懸浮液。然后在顯微鏡下計(jì)數(shù)，檢測孢子數(shù)量。

1.5.3 菌株干重測定

根據(jù)liu 等[13]的方法對抗性菌株與敏感性菌株干重進(jìn)行了測定。取10塊直徑5 mm的菌餅接種到250 Ml 三角瓶PDA液體培養(yǎng)基中，然后于22 ℃恒溫、120 r·min-1下分別振蕩培養(yǎng)3天。菌絲體經(jīng)四層紗布過濾，再用無菌水沖洗3次，吸水紙吸干水分后，放在烘箱內(nèi)80 ℃處理8 h，然后稱重。每個菌株培養(yǎng)3瓶，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.6 致病性測定

將直徑5 mm的菌餅接種番茄果實(shí)，于22 ℃黑暗培養(yǎng)，分別在第1、3、5 d測量病斑大小。每個菌株接種3個健康番茄果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 啶酰菌胺抗性菌株與敏感性菌株P(guān)AL活性比較

圖1為抗性菌株R1和敏感性菌株S1在不同濃度(1、5、25 μg·mL-1)啶酰菌胺處理后體內(nèi)PAL酶活性測定結(jié)果。在處理后24 h內(nèi)，兩菌株P(guān)AL活性變化趨勢基本一致，均呈現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，并且隨著藥物濃度增高酶活性也相應(yīng)升高。兩菌株均在處理后1.5 h時(shí)PAL酶活性達(dá)到鋒值，而后逐漸降低。很明顯在各處理濃度下，抗性菌株R1的PAL活性均高于敏感菌株S1。當(dāng)啶酰菌胺濃度25 μg·mL-1時(shí)，抗性菌株R1 PAL酶活達(dá)到118.75 μmol·min-1，為同條件下敏感性菌株S1 PAL(76.29 μmol·min-1)的1.56倍。

圖1 不同濃度啶酰菌胺處理后抗性菌株和敏感性菌株體內(nèi)PAL活性分析Fig.1 Analysis of PAL activity in the resistant strain and the sensitive strain after treatment with different concentration of Boscalida: 0 μg·mL-1; b: 1 μg·mL-1; c: 5 μg·mL-1; d: 25 μg·mL-1; R表示抗性菌株，S表示敏感性菌株a: 0 μg·mL-1; b: 1 μg·mL-1; c: 5 μg·mL-1; d: 25 μg·mL-1; R：resistant isolate R1，S: sensitive isolate S1

2.2 啶酰菌胺抗性菌株與敏感性菌株P(guān)OD活性比較

不同濃度啶酰菌胺處理后，抗性菌株R1和敏感性菌株S1體內(nèi)過氧化物酶(POD)的酶活力變化如圖2所示。兩菌株P(guān)OD活力變化趨勢基本一致，在24 h內(nèi)酶活性不斷升高，并且在24 h達(dá)到峰值。在各處理?xiàng)l件下，R1體內(nèi)POD活力明顯高于S1。在處理后24 h，抗性菌株酶活力增幅明顯大于敏感性菌株。

圖2 不同濃度啶酰菌胺處理后抗性菌株和敏感性菌株體內(nèi)POD酶活性分析Fig.2 Analysis of activity of POD enzyme in the resistant strain and the sensitive strain after treatment with different concentration of Boscalida: 0 μg·mL-1; b: 1 μg·mL-1; c: 5 μg·mL-1; d: 25 μg·mL-1; R表示抗性菌株，S表示敏感性菌株a: 0 μg·mL-1; b: 1 μg·mL-1; c: 5 μg·mL-1; d: 25 μg·mL-1; R: resistant isolate R1，S: sensitive isolate S1

并且隨著處理啶酰菌胺濃度增加(1、5、25 μg·mL-1)，所檢測的兩個菌株體內(nèi)POD活力也變大。當(dāng)啶酰菌胺濃度25 μg·mL-1時(shí)，抗性菌株R1 POD酶活達(dá)到175.26 μmol·min-1，為同條件下敏感性菌株S1 POD(68.43 μmol·min-1)的2.56倍。

2.3 適應(yīng)性評價(jià)

如表1所示，啶酰菌胺抗性菌株R1和敏感性菌株S1在菌絲生長、產(chǎn)孢量、菌絲干重以及對番茄果實(shí)的致病性方面沒有明顯的區(qū)別。

表1抗性菌株與敏感性菌株適應(yīng)性評價(jià)

Table1 Adaptive evaluation of resistant strains and sensitive strains

菌株Isolate菌落直徑/cmDiameter產(chǎn)孢量 /106·mL-1Amount of conidia菌株干重/gDry weight病斑大小/cmLesion diameter抗性菌株5.156.810.5231.57敏感菌株5.206.780.5271.56

3 結(jié)論與討論

灰霉病一直都是世界范圍內(nèi)蔬菜生產(chǎn)上的重要病害，因其寄主范圍廣、繁殖快、易變異等特點(diǎn)，給防治工作帶來困難。本試驗(yàn)檢測了啶酰菌胺抗性菌株R1和敏感性菌株S1的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(PDD)的酶活力，并對兩菌株適應(yīng)性和致病性進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度啶酰菌胺處理后，抗性與敏感性菌株0～24 h內(nèi)兩種類型菌株P(guān)AL和POD活性都有升高趨勢，但是抗性突菌株P(guān)AL和POD活性上升幅度較敏感菌株高。適應(yīng)性評價(jià)顯示啶酰菌胺抗性菌株和敏感性菌株在菌絲生長速率、產(chǎn)孢量、菌絲干重以及對寄主植物的致病性方面沒有明顯的區(qū)別。本研究將為啶酰菌胺抗性菌株的抗藥機(jī)理分析和田間科學(xué)用藥提供理論依據(jù)。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是一類疏水蛋白，分子量一般在300～340 kDa,在生物體內(nèi)普遍存在，在生物生長發(fā)育過程中及逆境條件下都會發(fā)生變化[14～16]。PAL與植物抗病性密切相關(guān)，受到病原物侵染后植物體內(nèi)PAL活性明顯升高[14]。已有研究報(bào)道稱抗藥性真菌的菌株中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，比如葡萄白腐病菌多菌靈抗性菌株體內(nèi)PAL活性一直高于敏感性菌株[17]；草莓枯萎病菌戊唑醇抗性菌株體內(nèi)PAL活性明顯高于敏感性菌株[18]；蘋果輪紋病的抗戊唑醇菌株在藥劑處理后1.5 h內(nèi)酶活性最高[12]。本研究發(fā)現(xiàn)啶酰菌胺處理后，抗性菌株及敏感菌株體內(nèi)PAL活性均先升高后下降，但是抗性菌株活性一直高于敏感菌株，這與前人研究結(jié)果類似。這說明PAL對真菌逆境條件下生存具有調(diào)節(jié)作用。

過氧化物酶(PDD)是一類同工酶，能夠催化過氧化氫和有機(jī)過氧化物對各種有機(jī)物和無機(jī)物的氧化作用。POD廣泛存在于動物、植物、真菌及細(xì)菌內(nèi)，依據(jù)來源可分為胞內(nèi)型、胞外型及分泌型，參與機(jī)體多種生理代謝功能[19]。POD參與真菌在逆境條件的生理代謝調(diào)節(jié)，保護(hù)細(xì)胞膜免受損傷[20]。本試驗(yàn)中，啶酰菌胺處理后24 h內(nèi)，灰霉菌抗性菌株及敏感性菌株的POD活性呈升高趨勢，并且明顯比后者要高。這與前人研究結(jié)果一致，蘋果輪紋病菌抗性菌株及敏感性菌株藥劑處理后體內(nèi)POD活性一直升高[12]。這說明POD活力大小與真菌抗藥性的強(qiáng)弱有緊密關(guān)系，但是能否作為衡量抗性強(qiáng)弱的指征還需要更多的研究工作來證明。

生物適應(yīng)性參數(shù)是影響一種病原菌抗藥性形成的重要因子，通常包括菌絲生長速率、干重、產(chǎn)孢量以及致病性[21]。本研究發(fā)現(xiàn)啶酰菌胺抗性菌株的適應(yīng)性參數(shù)值與敏感性菌株無明顯差異。這與前人研究結(jié)果一致，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)具有多種農(nóng)藥交叉抗性的灰霉菌株其適應(yīng)性與敏感性無明顯差別[22]。而研究者分析了來源不同寄主的灰霉菌對農(nóng)藥SYP-1620 的抗性和敏感性菌株的生物適應(yīng)性發(fā)現(xiàn)，抗性菌株的適應(yīng)性參數(shù)較低，但是差別不太明顯[7]。這可能與菌株采集的背景有一定關(guān)系。

綜上所述，啶酰菌胺處理后，番茄灰霉菌抗性菌株及敏感性菌體的生理生化特征都能發(fā)生顯著變化，PAL及POD活力大幅升高，但是抗性菌株變化幅度更大。而適應(yīng)性評價(jià)顯示兩類菌株無明顯差異，這需要進(jìn)一步的研究來闡述其原因。番茄灰霉菌是具有抗性風(fēng)險(xiǎn)的病原菌，容易對啶酰菌胺產(chǎn)生抗藥性。新型化學(xué)農(nóng)藥的使用需要科學(xué)指導(dǎo)，否則防治效果會下降。