柴喜榮,林 潔,楊 暹,康云艷
(華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院,廣東 廣州 510642)
疫病是危害黃瓜生產(chǎn)的毀滅性土傳病害,由疫霉菌侵染引起,苗期至成株期均可發(fā)病,潛育期短,傳播速度快,侵染力強,廣東省每年春植或夏、秋植黃瓜由疫病引起的死株率輕則10%,重則高達80%[1-2]。由于疫霉菌抗性來源的復雜性和疫霉菌發(fā)生遺傳變異的速度非常快,瓜類疫病抗性育種進展緩慢。目前,黃瓜品種中尚未發(fā)現(xiàn)對該病具有完全免疫或高抗的類型。一些農(nóng)業(yè)措施如輪作、嫁接、清潔田園等,均有一定的減輕病害的效果,但均不能從根本上控制病害[3]。植物誘導抗病性產(chǎn)生常常伴隨著病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis related protein,PRs)的大量積累。在這些PRs中,幾丁質(zhì)酶(Chitinase,CHT)和葡聚糖酶(Glucanase,GLU)具有直接殺傷或抵抗病原物的活性與作用[4-5];過氧化物酶(Peroxidase,POD)則參與細胞木質(zhì)化過程,使細胞壁加強、抗病性增加;苯丙氨酸解氨酶(Phenylalnine ammonialyase,PAL)是植物保衛(wèi)素、木質(zhì)素和酚類化合物合成的關(guān)鍵酶和限速酶;多酚氧化酶(Polyphenoloxidase,PPO)可以在植物受病原菌侵染時氧化酚生成醌,對病菌產(chǎn)生抑制和毒害作用[6]。
本試驗通過灌根接種約5×103個/mL甜瓜疫霉菌游動孢子懸浮液,對不同來源的7個黃瓜品種進行抗病性篩選,并以篩選出的中農(nóng)20號和正源油綠花青大吊瓜分別為感/抗品種,進一步探討疫霉菌對黃瓜葉片內(nèi)病程相關(guān)蛋白POD、PPO、PAL、GLU、CHT活性的影響,研究結(jié)果可為揭示黃瓜疫霉菌抗性生理機制提供理論依據(jù)。
供試黃瓜品種:中農(nóng)20號由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供,正源油綠花青大吊瓜由汕頭市利農(nóng)蔬菜良種研究所提供,長春密刺由哈爾濱金龍農(nóng)業(yè)有限公司提供,津優(yōu)1號由天津市黃瓜研究所提供,抗病二號、粵秀3號和早青二號由廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所提供。
供試菌種:甜瓜疫霉菌(Phytophthora melonis)由華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院提供。將病原菌接種在胡蘿卜培養(yǎng)基上,置于26℃的人工氣候箱黑暗培養(yǎng),7 d后加入適量土壤浸出液,26℃、全光照誘導游動孢子1~2 d,經(jīng)血球計數(shù)板計數(shù),配成終濃度約為5×103個/mL的游動孢子懸浮液。
胡蘿卜培養(yǎng)基:胡蘿卜200 g切片榨汁,加入蒸餾水浸泡5 min后過濾、定容至1 L,搖勻,然后按100 mL分裝,每瓶加入1.3 g瓊脂糖,121℃高壓蒸汽滅菌備用。
土壤浸出液:肥沃菜園土50 g,蒸餾水200 mL,攪拌,過濾,所得濾液即土壤浸出液。
試驗在華南農(nóng)業(yè)大學蔬菜試驗基地進行。2013年7月1日,將7個黃瓜品種種子浸種催芽,發(fā)芽后播于裝有草炭∶珍珠巖∶蛭石=1∶1∶1混合基質(zhì)的32孔育苗盤中,基質(zhì)經(jīng)134℃高溫蒸汽滅菌1 h,常規(guī)管理。7月14日黃瓜幼苗兩葉一心期,灌根接種約5×103個/mL疫霉菌游動孢子懸浮液,以清水作對照。接種前澆透水,取10 mL游動孢子懸浮液加至距植株莖基部2~3 cm處的基質(zhì)內(nèi),接種后將植株置于鑒定室內(nèi)保濕(RH為100%)24 h,以后保持土壤濕度近飽和,接種期間溫度控制在24~28℃。接種后2 d統(tǒng)計病情指數(shù),并取各處理植株的第2片真葉,用于PPO、POD、PAL、CHT、GLU活性的測定。每個處理3次重復,每個重復32株。
1.3.1 黃瓜疫病抗性鑒定 根據(jù)NY/T 1857-2010 《黃瓜主要病害抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程》稍作修改,游動孢子懸浮液接種量由2 mL/株改為10 mL/株,病情調(diào)查時間由接種后7 d 改為接種后3 d,計算病情指數(shù),并評價黃瓜品種的抗病性。
(1)病情分級。室內(nèi)病情分級及其癥狀描述見表1。
表1 黃瓜疫病病情分級標準
(2)病情指數(shù)。病情指數(shù)計算公式為:
式中,DI為病情指數(shù),s為各病情級別代表數(shù)值,n為各病情級別病株數(shù),N為調(diào)查總株數(shù),S為最高病情級別代表值。
(3)抗性評價標準。根據(jù)發(fā)病材料的病情指數(shù),確定其對疫病的抗性水平,劃分標準見表2。
表2 黃瓜對疫病抗性評價標準
1.3.2 酶活性測定 POD、PAL、PPO活性測定參照Chen等[7]的方法,CHT、GLU活性測定參照Ge等[8]的方法。
試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS Statistics 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。
如圖1所示,本試驗7個黃瓜品種接種5×103個/mL甜瓜疫霉菌游動孢子后,各品種對疫霉菌的抗性表現(xiàn)不同,由強到弱依次為花青大吊瓜>長春密刺>粵秀3號>抗病2號>津優(yōu)1號>中農(nóng)20號>早青2號。其中,長春密刺、正源油綠花青大吊瓜、抗病二號和粵秀3號 等4個品種病情指數(shù)范圍均表現(xiàn)出中抗,品種間抗性無顯著差異;中農(nóng)20號、早青二號和津優(yōu)1號3個品種病情指數(shù)范圍均表現(xiàn)出感病,品種間抗性亦無顯著差異。本試驗選定中抗品種花青大吊瓜、感病品種中農(nóng)20號進一步探討葉片中病程相關(guān)蛋白的變化規(guī)律。
圖1 不同黃瓜品種接種甜瓜疫霉菌后的病情指數(shù)
從圖2可以看出,未接種疫霉菌條件下,中抗品種葉片POD活性顯著高于感病品種;接種疫霉菌顯著誘導提高了抗感品種葉片POD活性,與對照相比,感病品種中農(nóng)20號POD活性提高150%,中抗品種花青大吊瓜提高91%,但中抗品種的POD活性仍然高于感病品種。
圖2 接種疫霉菌對黃瓜葉片POD活性的影響
從圖3可以看出,未接種疫霉菌條件下,中抗品種葉片PPO 活性顯著高于感病品種;接種疫霉菌顯著誘導提高了感病品種中農(nóng)20號葉片PPO活性,與對照相比,葉片PPO活性提高211%,而對中抗品種花青大吊瓜葉片PPO活性無顯著誘導作用。接種病原菌后,感病品種中農(nóng)20號葉片PPO活性顯著高于中抗品種花青大吊瓜。
圖3 接種疫霉菌對黃瓜葉片PPO活性的影響
由圖4可知,未接種疫霉菌條件下,中抗品種葉片PAL活性顯著高于感病品種;接種疫霉菌顯著誘導提高抗感品種葉片PAL活性,與對照相比,感病品種中農(nóng)20號PAL活性提高321%,中抗品種花青大吊瓜提高93%,但中抗品種的PAL活性仍然高于感病品種。
圖4 接種疫霉菌對黃瓜葉片PAL活性的影響
從圖5可以看出,未接種疫霉菌條件下,感病品種中農(nóng)20號葉片CHT活性顯著高于中抗品種花青大吊瓜;接種疫霉菌對抗/感品種葉片CHT活性均無顯著影響。
圖5 接種疫霉菌對黃瓜葉片CHT活性的影響
從圖6可以看出,未接種疫霉菌條件下,中抗品種葉片GLU 活性顯著高于感病品種;接種疫霉菌顯著誘導提高感病品種中農(nóng)20號葉片GLU活性,與對照相比,葉片GLU活性提高144%,而接種疫霉菌對中抗品種花青大吊瓜葉片GLU活性無顯著誘導作用。接種病原菌后,感病品種中農(nóng)20號葉片GLU活性顯著高于中抗品種花青大吊瓜。
圖6 接種疫霉菌對黃瓜葉片GLU活性的影響
本試驗以7個不同黃瓜品種進行疫病的抗病性篩選,其中長春密刺、正源油綠花青大吊瓜、抗病二號和粵秀3號4個品種抗性較強,為中抗品種;中農(nóng)20號、早青二號和津優(yōu)1號3個品種抗性較弱,為感病品種,沒有發(fā)現(xiàn)高抗或免疫品種。進一步的試驗以中農(nóng)20號和花青大吊瓜分別為感/抗材料,用于測定防御相關(guān)酶活性,結(jié)果表明,未接種疫霉菌條件下,正源油綠花青大吊瓜黃瓜葉片的POD、PPO、PAL、GLU活性均顯著高于感病品種中農(nóng)20號。接種疫霉菌游動孢子懸浮液后,中抗品種花青大吊瓜葉片的POD、PAL活性顯著升高,其余相關(guān)酶活性無顯著變化;感病品種中農(nóng)20號葉片POD、PPO、PAL、GLU活性顯著增強,且增幅均大于中抗品種花青大吊瓜;接種前后兩個品種的CHT活性均無明顯變化。由此可以推測,未接種疫霉菌條件下,中抗品種植株葉片內(nèi)含有更高的防御相關(guān)酶活性,病原菌侵染后,植株能迅速提高POD、PAL活性,增強細胞壁,來抵御病原菌的侵染;相反,未接種疫霉菌條件下,感病品種中農(nóng)20號葉片內(nèi)防御相關(guān)酶活性水平低,植株被疫霉菌侵染后,葉片內(nèi)除了POD、PPO、PAL細胞壁相關(guān)酶活性上升外,GLU活性也迅速升高,原因可能是病菌侵染細胞后,感病黃瓜品種的膜系統(tǒng)受損、透性增加,酶與底物無控制地接觸,從而表現(xiàn)為酶促反應加速、酶活性提高,GLU的合成與積累顯著被誘導,參與了植株對病原菌的防御;接種前后感/抗品種CHT活性均無明顯變化,原因可能是甜瓜疫霉菌細胞壁中沒有幾丁質(zhì),因此幾丁質(zhì)酶活性沒有受誘導。
POD、PPO、PAL是植物次生代謝過程中的3個關(guān)鍵酶,不僅是重要的內(nèi)源活性氧清除劑,而且主要負責催化細胞壁中的大分子物質(zhì)交聯(lián)以加強細胞壁的結(jié)構(gòu)或修復受損的細胞壁,屬于植物防衛(wèi)系統(tǒng)相關(guān)酶,因此可作為植物抗病的生化指標[9-11]。在植物抗病防御系統(tǒng)中,CHT和GLU的作用也受到普遍關(guān)注,如CHT和GLU能直接攻擊病原物,特別是病原真菌;GLU和CHT可以直接酶解病原真菌的細胞壁使致病病原物瓦解,失去致病能力;酶解后病原物的細胞壁破碎物又可以作為激發(fā)子再次刺激植物產(chǎn)生抗病防衛(wèi)反應,從而達到抗病的目的[12]。
POD、PPO、PAL、GLU、CHT與植物抗病性的關(guān)系在不同植物、多種病害的研究結(jié)論不甚一致。侯茜等[13]研究表明,POD、PPO、PAL、CHT的活性與抗病性呈正相關(guān),可用西瓜幼苗根部POD、PPO、PAL、CHT的活性作為反映苗期西瓜材料枯萎病抗性的生理生化指標;李新等[14]對黃瓜不同品種苗期感染枯萎病菌后幾種酶活性變化的研究發(fā)現(xiàn),接種枯萎病菌后,抗/感品種3種酶活性均增高,但抗病品種的酶活性增加幅度高于感病品種;相反,劉守偉等[15]對黃瓜與枯萎病菌的研究指出,不同抗性黃瓜品種接種枯萎病菌后抗/感品種POD、PPO活性都升高,但感病品種上升速度快、幅度大;張少英等[16]對甜菜與叢根病的研究發(fā)現(xiàn),供試4個甜菜品種的CHT和GLU活性均表現(xiàn)為抗病品種高于感病品種;左豫虎等[17]對大豆與疫霉根腐病的研究指出,大豆對大豆疫霉根腐病的抗性與CHT、GLU活性呈正相關(guān)關(guān)系;Liang等[18]對黃瓜與白粉病的研究指出,接種白粉病菌能夠誘導黃瓜葉片CHT活性升高,且CHT活性與黃瓜抗病性呈正相關(guān);而莫熙禮等[19]對辣椒與白粉病菌的研究指出,CHT活性與辣椒的抗病性無相關(guān)性,該結(jié)果與許多學者研究結(jié)果不一致。