張佳琪，唐仕歡，李德鳳，張 毅，蘇 瑾，劉 楊，張艾嘉，王 萍,，王喜軍

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心，哈爾濱 150040；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

六味地黃方最早出自宋代錢乙所著的《小兒藥證直訣》一書，由熟地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、茯苓、澤瀉6味藥組成[1]，是滋陰補腎的中醫(yī)經(jīng)典名方。六味地黃丸具有“三補三瀉”的特點：熟地黃滋陰補腎，澤瀉利水滲濕，瀉腎水；山茱萸溫澀肝經(jīng)，牡丹皮涼肝瀉火；山藥健脾固腎，茯苓滲濕健脾。六味合用，為“三補三瀉”之良劑，滋陰補腎之名方[2]。主要用于腎陰虛引起頭暈耳鳴，腰膝酸軟，骨蒸潮熱，盜汗遺精，消渴等癥狀。近年來，除了其傳統(tǒng)的滋陰補腎應(yīng)用外，還對糖尿病、高血壓、抗腫瘤、更年期綜合征等有大量的臨床應(yīng)用報道[3-5]。

糖尿病屬中醫(yī)“消渴”范疇，而消渴多以陰虛為本，六味地黃丸具有較好的滋陰補腎和降低血糖的作用，在治療糖尿病方面應(yīng)用最為廣泛且取得了較大的進展，方中各藥均有降糖的功效，療效確切[6-8]。但由于中藥復(fù)方的復(fù)雜性，其治療糖尿病的分子機制尚未得到完全闡釋。

中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床治療的主要方法和手段，以多成分作用于多靶點產(chǎn)生藥效，探索中藥復(fù)方的化學(xué)物質(zhì)實體和與機體生命活動的交互規(guī)律，科學(xué)地闡釋復(fù)方藥效的科學(xué)內(nèi)涵，是中醫(yī)藥理論研究的難點，也是中醫(yī)藥理論研究的關(guān)鍵科學(xué)問題。中藥整合藥理學(xué)以多學(xué)科交叉融合為基礎(chǔ)，廣泛應(yīng)用到中藥有效成分辨識、配伍理論、分子機制等方面[9]。整合藥理學(xué)強調(diào)宏觀與微觀、整體與局部、體內(nèi)ADME過程與活性評價、虛擬計算與實驗驗證的整合，擬解決的關(guān)鍵問題之一就是探索中藥復(fù)方的化學(xué)物質(zhì)實體與機體相互作用規(guī)律，系統(tǒng)闡釋中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)[10]。

為進一步發(fā)展整合藥理學(xué)研究新方法和技術(shù)，完善研究體系，拓展其在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所聯(lián)合北京大學(xué)藥學(xué)院、中國科學(xué)院相關(guān)機構(gòu)構(gòu)建中藥整合藥理學(xué)平臺(http://www.tcmip.cn/)。中藥整合藥理學(xué)平臺是以中醫(yī)藥大數(shù)據(jù)(中藥成分數(shù)據(jù)庫、中藥材數(shù)據(jù)庫、中藥方劑數(shù)據(jù)庫、疾病癥狀靶標數(shù)據(jù)庫)為基礎(chǔ)，以人工智能、數(shù)據(jù)模建和挖掘、網(wǎng)絡(luò)科學(xué)等為技術(shù)手段，在中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、分子機制探討、質(zhì)量控制、中藥新藥研發(fā)以及中藥臨床精準用藥等方面有較好的應(yīng)用，通過建立“中藥方劑-化學(xué)成分-作用靶標-疾病靶標”多維度關(guān)聯(lián)的有效工具，揭示中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子機制，為揭示中醫(yī)原創(chuàng)思維的科學(xué)價值和名醫(yī)經(jīng)驗傳承提供技術(shù)支撐[11]。

本研究借助整合藥理學(xué)平臺(http://www.tcmip.cn/)，探討六味地黃丸治療糖尿病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子機制，為六味地黃丸有效成分辨識及其質(zhì)量控制、分子機制與臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分來源

在整合藥理學(xué)平臺(http://www.tcmip.cn/)，收集中藥材“地黃”“山藥”“山茱萸”“茯苓”“澤瀉”“牡丹皮”的所有化學(xué)成分，建立六味地黃丸的化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫。

1.2 候選靶標來源

在整合藥理學(xué)平臺疾病/證候靶標數(shù)據(jù)庫，以“diabetes mellitus” “diabetes”“diabetic”作為疾病或癥狀關(guān)鍵詞進行檢索，勾選檢索出來的所有靶標，作為候選的疾病靶標。

1.3 靶標預(yù)測

對中藥靶標預(yù)測界面建立的化學(xué)成分庫中的成分進行化學(xué)結(jié)構(gòu)相似性對比，選取相似性分數(shù)大于等于0.8的成分預(yù)測靶標作為六味地黃丸作用的潛在靶標。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息(PPI)

六味地黃丸作用的潛在靶標與糖尿病疾病靶標之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息(PPI)，通過整合藥理學(xué)平臺的PPI數(shù)據(jù)庫獲得，該平臺鑲嵌了HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT、DIP、PDZBase等數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過整合藥理學(xué)平臺網(wǎng)絡(luò)分析模塊，針對六味地黃丸作用的潛在靶標與糖尿病疾病靶標之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息計算網(wǎng)絡(luò)特征值，以“節(jié)點連接度(degree)”的2倍中位數(shù)為卡值，選取中藥靶標-疾病基因互作網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(hubs)；在此基礎(chǔ)上，以“degree”“節(jié)點緊密度(closeness)”和“節(jié)點介度(betweenness)”的中位數(shù)為卡值，選取同時滿足3個卡值的節(jié)點為中藥方劑矯正疾病失衡網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶標網(wǎng)絡(luò)。然后，對關(guān)鍵靶標網(wǎng)絡(luò)進行通路富集分析，選取P-Value前30的通路，構(gòu)建“中藥方劑-中藥材-化學(xué)成分-核心靶標-關(guān)鍵通路”的多層次關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，并對關(guān)鍵靶標網(wǎng)絡(luò)和多層次關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)進行可視化。

1.6 基因功能和通路富集分析

基因功能和通路富集分析在整合藥理學(xué)評價進行，相關(guān)信息來自于GO數(shù)據(jù)庫(http://www. geneontology.org)和KEGG通路數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, http://www.genome.jp/kegg/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 六味地黃丸化學(xué)成分靶標預(yù)測

地黃收集化學(xué)成分38個共預(yù)測出690個靶標，山茱萸收集化學(xué)成分72個預(yù)測出774個靶標，山藥收集化學(xué)成分61個預(yù)測出1 091個靶標，牡丹皮收集化學(xué)成分15個預(yù)測出11個靶標，茯苓收集化學(xué)成分33個預(yù)測出747個靶標，澤瀉收集化學(xué)成分31個預(yù)測出117個靶標，各味中藥共有靶標情況見表2。

表1 “中藥-成分-靶標”基本信息Tab.1 The information of traditional Chinese medicine-compound-taget

地黃主要化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜及其他糖苷類、氨基酸、微量元素等，已有研究表明，地黃寡糖可以降低糖尿病大鼠的血糖血脂水平[12]，而且對高胰島素誘發(fā)的HepG 2細胞胰島素抵抗具有明顯改善作用[13]。

山茱萸主要化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜類、鞣質(zhì)類、黃酮類等，有文獻報道山茱萸總萜可通過抑制α-葡萄糖苷酶減少糖類吸收，通過非胰島素依賴途徑發(fā)揮其降糖作用[14-15]，山茱萸環(huán)烯醚萜總苷可顯著抑制AGEs誘導(dǎo)的大鼠腎系膜細胞炎癥反應(yīng)，對糖尿病腎病也具有一定保護作用[16]。

山藥主要化學(xué)成分有皂苷、糖、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、多種氨基酸等，山藥最主要的藥用成分是山藥多糖，目前已有研究表明山藥多糖具有修復(fù)和保護胰島細胞的作用，并且能夠降低顯著血清中胰高血糖素水平[17]。

牡丹皮主要化學(xué)成分有丹皮酚、丹皮酚苷類、黃酮類、多糖、鞣質(zhì)等，有文獻報道牡丹皮多糖可顯著降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖，改善糖耐量降低[18]，牡丹皮苷/酚可通過抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Smad2/3，P38MARK通路活化從而達到對糖尿病腎病大鼠腎損傷的保護作用[19]。

茯苓主要化學(xué)成分有茯苓多糖、三萜類化合物甾醇、脂肪、腺嘌呤等，其中茯苓多糖能有效降低Ⅱ型糖尿病小鼠血糖、血清胰島素和胰高血糖素水平，并且對糖尿病引起的脂質(zhì)代謝紊亂有一定改善作用[20]。

澤瀉主要化學(xué)成分5種三萜類化合物，另有揮發(fā)油、小量生物堿、天門冬素、甾醇、脂肪酸、蛋白質(zhì)等，已有文獻報道澤瀉具有能夠降低大鼠空腹血糖，調(diào)節(jié)糖、脂代謝，從而達到治療糖尿病的功效[21-22]。

2.2 六味地黃丸治療糖尿病的核心靶標網(wǎng)絡(luò)、基因功能和通路富集分析

2.2.1 核心靶標網(wǎng)絡(luò)分析

通過整合藥理學(xué)分析的網(wǎng)絡(luò)分析模塊，基于PPI相互作用數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建六味地黃丸藥物組合潛在靶標與疾病靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)條件篩選出關(guān)鍵靶標232個，根據(jù)Degree值圖1僅顯示前100個靶點，圖中節(jié)點的大小與Degree值成正比關(guān)系，其中核心組合化學(xué)成分直接作用節(jié)點55個，疾病靶點14個。

圖1 六味地黃丸調(diào)節(jié)糖尿病候選靶標網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 The network of LiuweiDihuang candidate targets for diabetes mellitus Red.Putative Drug Target; Yellow. Known Disease Target; Gray. Others

從圖1中可以看出，疾病和藥物雖然無共同靶點，但14個疾病靶點與多個藥物靶點相關(guān)聯(lián)。有研究表明PRKCB基因編碼的蛋白激酶C-β通過PKC信號通路在糖尿病及其并發(fā)癥中起著重要的作用[23]，動物實驗發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C-β缺陷小鼠可以避免高血糖引起的腎功能障礙、氧化應(yīng)激及微量白蛋白尿的損害[24]，使用蛋白激酶C-β抑制劑，可以改變糖尿病患者的血流動力學(xué)，減少細胞外基質(zhì)積聚、降低腎小球濾過率及微量白蛋白尿，預(yù)防高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，改善糖尿病大鼠高血糖誘導(dǎo)的心肌細胞肥大，LVH和舒張功能障礙[25]，推測六味地黃丸可通過抑制蛋白激酶C活性治療糖尿病。α-葡萄糖苷酶(GAA)等酶通過參與調(diào)控糖代謝環(huán)節(jié)引發(fā)糖代謝異常，是引發(fā)糖尿病的主要病理因素之一，臨床常使用α-葡萄糖苷酶抑制劑抑制α-葡萄糖苷酶活性，降低糖尿病患者體內(nèi)血糖水平，治療糖尿病[26]。血小板源生長因子受體(PDGFR)在糖尿病足創(chuàng)面愈合方面起著重要作用，國內(nèi)有學(xué)者對糖尿病患者和正?；颊咂つw進行研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者皮膚潰瘍組織PDGFR-α和PDGFR-β與正常患者相比表達顯著下降[27]。藥物靶標中有葡萄糖激酶(GCK)，葡萄糖激酶參與糖代謝的各個途徑，是糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，能夠通過增加胰島素的釋放和促進肝臟葡萄糖的利用來降低血糖，對維持血糖穩(wěn)態(tài)起重要作用[28-29]，推測六味地黃丸可能通過促進胰島細胞分泌葡萄糖激酶達到治療糖尿病的效果。六味地黃丸還作用于PLCD1、PLD1、PLD2、PLA2G2D等藥物靶標，與糖尿病腎病相關(guān)的一個很重要的機理是蛋白激酶的活化，蛋白激酶活化會導(dǎo)致磷脂代謝紊亂，蛋白激酶通路的活化將引起磷脂酶A2活性升高，磷脂酶A2是體內(nèi)重要的磷脂酶，催化磷脂裂解產(chǎn)生游離得花生四烯酸。所以糖尿病腎病體內(nèi)的磷脂水平和病理直接相關(guān)[30]，磷脂酶D也可通過激活蛋白激酶C在糖尿病及其并發(fā)癥起作用[31]，推測六味地黃丸對糖尿病及其并發(fā)癥引起的磷脂代謝紊亂具有一定的調(diào)節(jié)改善作用。

2.2.2 基因功能分析

通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫的基因和功能分析，六味地黃丸藥物靶標與疾病靶標基因功能分析結(jié)果顯示有ATP結(jié)合、線粒體等與能量代謝有關(guān)的條目，推測糖尿病可能與能量代謝有關(guān)聯(lián)。查閱文獻得知糖尿病常常伴隨著能量代謝紊亂，糖尿病大鼠與正常大鼠相比ATP合成顯著下降，Na+-K-ATP酶活性顯著降低[32]。黃連素通過抑制線粒體的功能，激活A(yù)MPK信號通路來改善胰島素抵抗[33]。此外，六味地黃丸還與蛋白激酶活性有關(guān)，進一步證明六味地黃丸可通過抑制蛋白激酶C活性治療糖尿病。基因功能分析結(jié)果顯示還具有谷氨酸受體信號通路、谷氨酸結(jié)合等氨基酸相關(guān)的多個條目(見表3)。

表3 六味地黃丸治療糖尿病關(guān)鍵靶標基因功能信息Tab.3 The target functional information of LiuweiDihuang Pills on the diabetes mellitus

2.2.3 通路富集分析

通過整合藥理學(xué)平臺進行靶標通路富集分析，關(guān)鍵通路根據(jù)P-Value值僅顯示前30條通路，靶標通路富集分析結(jié)果顯示主要集中丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、VEGF信號通路、Ras信號通路、鈣信號通路、TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)等信號通路以及乙型肝炎等疾病相關(guān)通路(表4)。

2.3 中藥方劑治療疾病“核心成分-關(guān)鍵靶標-主要通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

圖2可看出相關(guān)通路主要有丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等多個氨基酸代謝通路以及血管內(nèi)皮細胞生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)，Ras信號通路(Ras signaling pathway)，鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(Calcium signaling pathway)等多種信號通路。氨基酸可通過三羧酸循環(huán)參與糖脂代謝，影響著Ⅱ型糖尿病的發(fā)生發(fā)展，有研究證明Ⅱ型糖尿病大鼠會發(fā)生嚴重的氨基酸代謝紊亂，丙氨酸、谷氨酰胺和精氨酸水平下降，促進炎癥反應(yīng)，降低胰島素敏感性[34]。有研究表明通過調(diào)節(jié)Ras信號通路阻斷VEGF介導(dǎo)的糖尿病腎病可以顯著降低動物模型的腎小球超濾和白蛋白尿[35]。這些通路相關(guān)的核心靶標60個，與71個六味地黃丸化學(xué)成分相關(guān)聯(lián)，方中各藥在治療糖尿病中均發(fā)揮了重要作用。

表4 六味地黃丸治療糖尿病關(guān)鍵靶標通路信息Tab.4 The target pathway information of LiuweiDihuang Pills on the diabetes mellitus

圖2 中藥方劑治療疾病”核心成分-關(guān)鍵靶標-主要通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.2 The “compound-target-pathway” network of LiuweiDihuang Pills. Green.Triditional Chinese medicine; Purple.Compound; Blue. Target;Red.Pathway

3 結(jié)論

由于中藥復(fù)方具有成分復(fù)雜，配伍靈活，作用于多靶點，能夠干預(yù)多條信號通路的特性，因此難以全面描述其與人體的作用規(guī)律，這也成為制約當前中藥發(fā)展的瓶頸問題。中藥整合藥理學(xué)計算平臺以中醫(yī)藥大數(shù)據(jù)(中藥方劑數(shù)據(jù)庫、中藥材數(shù)據(jù)庫、中藥成分數(shù)據(jù)庫、疾病癥狀靶標數(shù)據(jù)庫)為支撐，以人工智能、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)科學(xué)等為手段，構(gòu)建滿足個體需求的自助式服務(wù)平臺。通過建立“中藥方劑-化學(xué)成分-作用靶標-疾病靶標”多維度關(guān)聯(lián)的有效工具，有效揭示了中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子機制，為中藥及中藥復(fù)方的研究提供更多的參考。本研究借助中藥整合藥理學(xué)計算平臺，分析六味地黃丸治療糖尿病的作用物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子機制，發(fā)現(xiàn)多種成分的靶點如PRKCB、GAA、GCK等與糖尿病相關(guān)聯(lián)，推測其可能通過調(diào)節(jié)丙氨酸、谷氨酸代謝等氨基酸代謝、能量代謝及糖脂代謝等多種代謝紊亂治療糖尿病。

六味地黃丸治療糖尿病已經(jīng)取得了很好的療效，對其分子機制及發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究可以為六味地黃丸及其所含中藥成分的進一步研究提供依據(jù)，也可以為糖尿病的臨床治療提供借鑒與參考。本研究是基于整合藥理學(xué)平臺的預(yù)測，具體機制及物質(zhì)基礎(chǔ)還需通過實驗加以驗證，相信本研究能夠為六味地黃丸的進一步研究及糖尿病的治療工作的開展提供一些有益的參考。