樊麗娜，胡雪剛，邱在玲，呂紅兵，周文土，傅 升

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是最常見的頭頸部鱗狀細胞癌，其局部浸潤和淋巴結轉移率很高，5年生存率為40%～50%［1－2］。因此迫切需要深入探索 OSCC的分子特征，尋找新的靶向治療策略。

微小RNA（microRNA，miR）是一類內源性小分子非編碼RNA分子（18～25個核苷酸），能夠與靶mRNA特異性結合，從而降解或抑制mRNA的蛋白質翻譯［3］。miR在細胞發(fā)育、分化、增殖、細胞周期調控、細胞凋亡和代謝等多個生物學過程中發(fā)揮重要作用［4－7］。但是，目前缺乏對 OSCC中 miR表達譜的全面和系統(tǒng)的分析。本研究使用癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫發(fā)布的OSCC miR高通量數據來篩選人OSCC與正常組織之間的差異表達miR，并進行其靶基因的預測和GO功能富集分析。

1 材料與方法

1.1 TCGA 中 miR 數據集 從 TCGA（http：／／cancergenome.nih.gov／）數據庫下載人 OSCC的組織樣本和正常組織樣本的miR的表達數據，使用Illumina HiSeq系統(tǒng)檢測miR的表達水平，作為TCGA的第3階段數據，提取標準化miR數據，去除零表達數據。

1.2 篩選差異表達的miR 使用R軟件的edger函數篩選差異倍數＞2、P＜0.05條件下正?？谇唤M織樣本和OSCC組織樣本之間的差異表達miR，繪制OSCC與癌旁組織差異miR火山圖，選取其中差異倍數＞10，P＜0.01的miR進行熱圖繪制。

1.3 差異表達miR靶基因預測與篩選 使用TargetScan軟件預測差異 miR靶基因［8］。運用Venny工具進行集合，獲取與OSCC相關差異miR的共同靶基因。

1.4 差異表達miR靶基因的GO功能富集分析采用 DAVID（https：／／david.ncifcrf.gov／home.jsp）在線工具對集合得到差異miR的共同靶基因進行GO功能富集分析［9］，P＜0.01為差別有統(tǒng)計學意義。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0與 GraphPad Prism 7進行統(tǒng)計學處理。OSCC與癌旁組織的miR表達比較采用非配對t檢驗。P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 樣本間miR表達數據 根據篩選條件下載的389個樣本共有1 599個miR表達譜，包括44個正常組織樣本和345個OSCC組織樣本。

2.2 OSCC與癌旁組織間差異miR的篩選 在正常組織樣本和OSCC組織樣本之間共有402個差異miR（差異倍數＞10，P＜0.05），其中表達上調的有250個，表達下調的有152個。通過上述分析結合t檢驗，繪制OSCC組織樣本及癌旁組織樣本間差異miR火山圖（圖1），其中差異倍數＞10，P＜0.01的miR共17個（6個下調，11個上調）（圖2），對這17個差異miR進行聚類熱圖繪制（圖3）。

圖1 口腔鱗癌和癌旁組織二者差異miR火山圖Fig 1 The volcano map between oral squamous cell carcinoma and adjacent tissues of differential miR

2.3 差異miR靶基因預測及篩選 應用靶基因預測網站對差異miR的靶基因進行預測，篩選得到差異miR及其預測靶基因數目（表1）。利用Venny工具對預測的靶基因進行集合，獲取OSCC差異miR的共同靶基因564個，其中上調的差異miR有561個共同靶基因，下調的差異miR有3個共同靶基因（圖4）。

圖2 口腔鱗癌和癌旁組織間17個顯著差異表達miRFig 2 17miR were expressed differentially between oral squamous cell carcinoma and adjacent tissues

圖3 口腔鱗癌和癌旁組織間17個顯著差異表達miR熱圖Fig 3 Heatmap of differentially expressed seventeen－miR between oral squamous cell carcinoma and adjacent tissues

圖4 差異miR靶基因的Venn圖Fig 4 Venn diagrams of differential miR target genes

2.4 靶基因的GO功能富集分析 通過GO注釋描述得到15個基因的GO細胞組分、22個基因的GO分子功能及93個基因的GO生物學過程的注釋信息（圖5）。結果顯示，差異表達的基因主要分布在細胞外膜、細胞器膜、突觸等，參與前體miR過程，正調控大分子生物合成過程，RNA過程，蛋白酶參與細胞蛋白降解過程、正調控細胞增殖過程，發(fā)揮蛋白結合、RNA結合、鈣離子結合、金屬離子結合、轉換生長因子受體結合、結構活性分子等功能（表2）。

3 討 論

過去幾十年，已有大量的基礎和臨床研究揭示了OSCC的形成、進展和潛在機制，而大多研究集中在單個基因或者單一隊列。目前，癌癥的早期診斷和疾病進展的檢測對于有效治療OSCC和獲得理想的臨床效果至關重要。因此，需要進一步對OSCC的生物標志物和治療靶點進行研究，以便OSCC的早期診斷、病理鑒定、治療和監(jiān)測。

圖5 靶基因的GO功能富集分析Fig 5 Enrichment of functions of the target genes was conducted by GO

表1 口腔鱗癌中差異miR及其預測靶基因數目Tab 1 Differential miR and their target genes in OSCC

本研究使用來自TCGA數據庫提供的數百個高通量的miR表達譜數據鑒定正常組織樣本與相應的腫瘤組織樣本相關的基因突變和失調，也有一些研究使用TCGA數據對現有的生物標記物進行獨立驗證［10－12］。miR作為非編碼RNA的家族成員參與基因水平的調控，因為其在檢測人類各種癌癥時表現出的穩(wěn)定性和便利性，已被公認為重要的干預靶標和預測工具［13－14］。大量研究證實，miR 在OSCC中具有致癌或抑癌作用。Lin等表明，OSCC患者血漿中的miR－24表達水平顯著高于對照［15］；Hung等研究證實，血漿中miR－146a水平升高對OSCC有診斷價值，且通過靶向調控IRAK1、TRAF6和NUMB基因增強致癌性［16］。

表2 差異表達基因的GO分析Tab 2 GO analysis of differently expressed genes

在本研究中，筆者整合了來自TCGA中大量的高通量數據，利用生物信息學方法對這些數據進行深度分析，篩選出顯著差異表達的miR共17個（6個顯著下調，11個顯著上調）。Xie等研究表明，miR－375是影響肝癌患者生存期的獨立因素，其低表達與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，可作為指導肝癌治療和預后的生物標志物［17］。本研究結果與之一致。Siow等證實，miR－375的低表達與OSCC的晚期病變、腫瘤大小和侵襲模式顯著相關，提示它在OSCC的發(fā)生中起重要作用［18］。Hou等的研究也證明，miR－196b在OSCC中的表達水平顯著高于相鄰的正常組織樣本，其高表達可促進口腔癌細胞的遷移和侵襲能力，而沉默miR－196b的表達可抑制口腔癌細胞的體外遷移和侵襲，miR－196b可以作為OSCC潛在的預后標志物或治療靶標［19］。其他差異表達miR大部分都與腫瘤有著密切的關系［20－23］。因此，推測篩選出的差異表達miR或許可作為OSCC的診斷生物標志物及治療靶標。

本研究對差異miR靶基因進行GO注釋富集分析時發(fā)現，靶基因顯著富集離子，特別是鈣離子的運輸。Ca2＋可通過激活或抑制細胞信號通路，從而調控多種細胞生物過程，許多Ca2＋介導的信號通路參與腫瘤侵襲或轉移過程［24］。已有研究報道，一些Ca2＋通道或Ca2＋泵的異常表達可能與腫瘤的發(fā)生有關。Gonzales等研究證實，TRPV1通道在OSCC中表達，且TRPV1拮抗劑能夠有效抑制OSCC細胞在體內生長［25］；Saito等表明，PMCA1的下調與OSCC的進展顯著相關，TRPM8在前列腺癌中高表達，而SERCA3在結腸癌中表達下調［26］。此外，功能注釋結果同樣表明，差異表達的基因主要分布在細胞膜、細胞器膜等與細胞生物學活動密切相關的部位，參與前體miR合成、細胞蛋白降解、蛋白激酶合成等生物過程，發(fā)揮與RNA結合、鈣離子結合、轉換生長因子受體結合等涉及發(fā)育和轉錄的分子功能。

綜述所述，本研究利用信息生物學方法篩選出hsa－miR－105－1、 hsa－miR－105－2、 hsa－miR－767、hsa－miR－1269b、hsa－miR－548f－1、hsa－miR－1269a、hsa－miR－885、hsa－miR－375、hsa－miR－135a－2等11個在OSCC組織樣本中顯著差異表達的miR，這些差異miR或許可作為OSCC潛在的生物標志物，為OSCC患者的診斷或靶向治療研究提供重要的實驗依據。