葉楠楠,裴希超,孫善華

蜱類是一種分布廣泛的攜毒媒介生物,蜱可攜帶83種病毒、14種細(xì)菌、17種回歸熱螺旋體、32種病原蟲,其中大多數(shù)是自然疫源性疾病,在東北地區(qū)較為常見的蜱傳疾病有蜱傳腦炎病毒、萊姆病螺旋體、巴爾通體、無形體病毒及斑點(diǎn)熱立克次體等[1].近年來,一些新發(fā)或再度肆虐的蜱傳疾病對(duì)人畜的危害日趨嚴(yán)重,中國(guó)已有河南省、湖北省、山東省、安徽省、江蘇省等省報(bào)告蜱傳類疾病病例280多人,死亡10余人[2-3].

我國(guó)黑河口岸與俄羅斯接壤,是我國(guó)對(duì)俄羅斯貿(mào)易的重要口岸,也是我國(guó)蜱傳腦炎、萊姆病等蜱媒疾病疫區(qū)之一,綿延的邊境線地區(qū)多為濕地與灌木林,使該地區(qū)的生境更具有多樣性,為蜱類的孳生提供了良好條件.近年來,我國(guó)對(duì)俄輸出勞務(wù)人員的不斷增加,其中多數(shù)在俄從事種植及林木采伐工作,蜱傳疾病的感染及傳入風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加,會(huì)對(duì)輸入國(guó)的衛(wèi)生安全特別是口岸地區(qū)的衛(wèi)生安全造成較大危害[4].每年蜱活動(dòng)的高峰期,在野外作業(yè)的工作人員都極容易遭蜱叮咬而產(chǎn)生患病可能,從而給自身生命安全帶來危害[5].一些重要的新發(fā)蜱傳疾病,如萊姆病、人粒細(xì)胞無形體病、巴貝西原蟲病、巴爾通體病、斑點(diǎn)熱等在黑龍江地區(qū)均有報(bào)道[6-7].

本文主要對(duì)黑龍江省黑河區(qū)域內(nèi)蜱種群密度、數(shù)量、分布以及季節(jié)變遷方面的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及總結(jié),建立黑河口岸蜱傳疾病的有效監(jiān)測(cè)及攜帶病原體的快速檢測(cè)分子生物學(xué)方法,建立快速、成熟穩(wěn)定蜱傳染病的PCR檢測(cè)體系,對(duì)及時(shí)快速監(jiān)測(cè)該口岸地區(qū)的新發(fā)蜱媒病發(fā)情況有重要意義,為科學(xué)的診斷和預(yù)防黑河地區(qū)蜱傳流行疾病提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持,同時(shí)為全國(guó)生物安全防御提供有力保障.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蜱采集時(shí)間及地點(diǎn) 從2012年4月開始,每個(gè)月上旬10日、下旬25日各一次,每次3人,采集1 h(遇到雨天順延),每天在蜱活動(dòng)高峰時(shí)間(10∶00到15∶00)捕蜱,9月份后連續(xù)2次捕蜱數(shù)為零時(shí)結(jié)束調(diào)查.利用布旗法釆集蜱蟲,連同草葉一起裝到濕潤(rùn)的塑料瓶中,用記號(hào)筆標(biāo)明好采集的地區(qū)、種類以及日期.采集到的蜱類進(jìn)行種屬鑒定;鑒定后的蜱類進(jìn)行病原體檢測(cè).地點(diǎn)位于我國(guó)黑龍江省黑河市,具體地點(diǎn)及環(huán)境如表1.

表1 黑河市蜱類的采集地點(diǎn)及生境描述Tab.1 Description of the sample sites and habitat

1.1.2 主要試劑材料及儀器設(shè)備 Taq酶(M7845)、AMV 反轉(zhuǎn)錄(Fasr Quant RT Kit with Gdna KR106-1)試劑盒生產(chǎn)商promaga公司;RNA提取試劑盒采用tiangen的動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(DP431)、基因組DNA提取試劑盒生產(chǎn)商Qiagen公司的DNeasy Blood&Tissue Kit(96506);大腸桿菌感受態(tài) DH5α、d NTPs、DL2000 DNA marker、T載體生產(chǎn)商均為寶生物工程(大連)有限公司.CX41RF生物顯微鏡廠商奧林巴斯有限公司;SZ61TR體視顯微鏡廠商奧林巴斯儀器設(shè)備有限公司;Nuaire NU430-600E生物安全柜廠商蘇州宏瑞凈化科技有限公司;Bio-radPower Pac Basic∕Wide Mini Sub-Cell電泳儀廠商上海天能科技有限公司;Sigma 3k15冷凍臺(tái)式離心機(jī)廠商德國(guó)Sigma公司;MINILUMix凝膠成像系統(tǒng)廠商美國(guó)Media Cybernetics公司;ABI VERITI PCR擴(kuò)增儀廠商美國(guó)ABI公司;QIAGEN TissueLyser LT組織細(xì)胞破碎儀廠商凱杰生物技術(shù)有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)本的采集與保存 采集標(biāo)本前,在裝蜱蟲的儲(chǔ)存管中放入一小團(tuán)用水浸泡過的棉花,后將采集到的蜱蟲標(biāo)本存放在標(biāo)本收集管中,用膠布封好瓶蓋并標(biāo)號(hào),同時(shí)錄入標(biāo)本采集背景資料表.采集到的活蜱,要雌雄分開保存,可直接放入蜱盒或大試管中(塑料材質(zhì)為佳),在蜱盒底墊上1～2 cm的細(xì)沙,細(xì)沙上布滿1～2 cm經(jīng)過處理的棉花,之后要使用濾紙片覆蓋并壓實(shí)、擠緊不留孔隙.然后將蜱放入,并放入干濾紙條,最后用潤(rùn)濕的棉花塞封口(濕度以擠不出水為宜),注意保存容器應(yīng)有透氣小孔.如天氣較熱(大于16℃),可將蜱盒置于4℃的冰箱內(nèi)保存,可保存5～10 d.在采集或保存過程中,如遇標(biāo)本死亡可直接用75%的酒精保存.

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將采集的蜱標(biāo)本用蒸餾水沖洗,并用超聲波清洗儀清洗20 min,待干燥后用75%酒精進(jìn)行固定,4℃冰箱中保存.將保存在75%酒精中的標(biāo)本取出干燥后,在解剖顯微鏡下進(jìn)行觀察,進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)鑒定,整理并記錄.

1.2.3 病原體的分子生物學(xué)鑒定

1.2.3.1 引物的合成 不同蜱傳病原體PCR檢測(cè)引物合成及目的基因如表2.

表2 蜱類檢測(cè)所用引物及目標(biāo)基因Tab.2 Experiment primer and reaction condition

1.2.3.2 病原體的PCR擴(kuò)增檢測(cè)

①PCR擴(kuò)增檢測(cè) 以提取的DNA為模板,按照表2-2列出的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用于檢測(cè)蜱類伯氏疏螺旋體、巴貝西蟲、無形體、立克次體(屬)、埃立克體、土拉菌、巴爾通體、Q熱立克次體;因此對(duì)于這幾種病原體的檢測(cè)以提取的DNA為模板.擴(kuò)增反應(yīng)體系包括Taq酶1.25 U,10×PCR buffer 5 μL,d NTPs mixture 0.2μmol/L,上下游引物0.5 μmol/L,模板DNA約為0.5μg,補(bǔ)充無菌水使總體積達(dá)到25μL.

②RT-PCR檢測(cè) 加入1μL RNA、d NTPs 0.4 pmol/L、1.25 U 的 RNase抑制劑、0.5μg的random primer、1.5 U的AMV反轉(zhuǎn)錄酶,加入適量的水至20μL進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)條件為室溫放置10 min,42℃保溫1 h,之后95℃,10 min后結(jié)束反應(yīng),反應(yīng)完畢后將反應(yīng)體系稀釋至100μL.取稀釋后反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL進(jìn)行PCR,森林腦炎擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min,然后35個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)94℃變性30 s,50℃退火40 s,70℃聚合60 s,最后72℃延伸5 min.同樣為RNA病毒的布尼亞屬的擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min,共39個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)94℃變性60 s,54℃退火60 s,72℃聚合60 s,最后72℃延伸5 min.

每檢測(cè)組設(shè)一例陰性對(duì)照,以DEPC處理過的水代替DNA模板.擴(kuò)增到的片段經(jīng)過膠回收后與p MD-18T載體連接后送北京三博遠(yuǎn)志測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序.陽(yáng)性率計(jì)算公式:陽(yáng)性率＝檢測(cè)出陽(yáng)性蜱數(shù)/采集到的總蜱數(shù)×100%.普通PCR法采用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行目的條帶的分離,Gelred染色后紫外燈下觀察是否具有表一中的目的條帶,每組設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照.

陽(yáng)性基因片段PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,開始大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)細(xì)胞的制備采用CaCl2溶液法小量制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,所有操作都在無菌條件下進(jìn)行:

①用冷卻的無菌吸頭吸取感受態(tài)細(xì)胞懸液200 μL加到微量離心管中,每管加DNA(體積≤10μL,DNA≤50μg)輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)溶物,在冰上放置30 min.

②42℃熱激90 s,迅速將離心管放到冰浴中,冷卻1～2 min.加入800μL LB液體培養(yǎng)基,37℃溫和振蕩(250 r/min)培養(yǎng)60 min,使細(xì)菌復(fù)蘇.

③4 000 r/min,離心5 min,吸出上清900μL,保留100μL菌液涂布于在加了40μL 2%X-gal貯存液和7μL 20%IPTG并含50 mg/L Amp的LB固體平板上,37℃倒置培養(yǎng)12～16 h.

④于4℃將平板放置數(shù)小時(shí),使藍(lán)色充分顯現(xiàn).

1.2.3.3 重組質(zhì)粒的鑒定 連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后,通過氨芐篩選挑出陽(yáng)性克隆菌株.用轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的菌落進(jìn)行PCR檢測(cè),在PCR反應(yīng)管中加好PCR反應(yīng)試劑,然后用無菌槍頭挑取抗性篩選出的小部分單菌落,設(shè)空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照,PCR反應(yīng)體系和程序與擴(kuò)增程序相同.檢測(cè)后,挑取陽(yáng)性菌落接種于含Amp(50μg/m L)的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜,以提取質(zhì)粒.質(zhì)粒提取采用?；举|(zhì)粒小量提取試劑盒.

1.2.3.4 序列測(cè)定及分析 DNA序列測(cè)定由華大基因測(cè)序技術(shù)公司和上海生工測(cè)序完成.應(yīng)用DNAMAN軟件對(duì)克隆的基因序列和GenBank上的相應(yīng)序列進(jìn)行序列同源性分析和比對(duì).

2 結(jié) 果

2.1 黑龍江省黑河地區(qū)蜱類采集情況 2012年至2014年每年4月16日至10月8日期間在黑河口岸地區(qū)的蜱類采集活動(dòng)中,共獲得蜱類1 343只,經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定分屬3屬3種,其中森林革蜱1 054只占總體構(gòu)成78.48%為優(yōu)勢(shì)蜱種;嗜群血蜱236只占總體構(gòu)成17.57%;全溝硬蜱53只占總體構(gòu)成3.94%,具體結(jié)果如表3所示.

表3 黑河市蜱的采集種類表Tab.3 Description of the sample sites and habitat,Heihe

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

2.2.1 森林革蜱形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 雄蜱:個(gè)體大小4.5 mm×2.9 mm(包括假頭).假頭基呈矩形,寬稍大于長(zhǎng).須肢粗短,其第2節(jié)稍長(zhǎng)于第3節(jié).口下板齒式排列前4/4,后3/3.盾板卵圓形,表面琺瑯彩比較濃,中垛最窄.氣門板呈長(zhǎng)逗點(diǎn)形,背突較窄,向背方微彎,其末端伸達(dá)盾板邊緣,背緣無幾丁質(zhì)增厚部.4對(duì)足粗壯,第1對(duì)足基節(jié)外距明顯短于內(nèi)距.第4對(duì)足基節(jié)大而向后延伸,外距超出該節(jié)后側(cè)緣.第1對(duì)足轉(zhuǎn)節(jié)背距發(fā)達(dá),呈三角形,其末端尖細(xì).第4對(duì)足脛節(jié)、前跗節(jié)、跗節(jié)內(nèi)緣各有3個(gè)齒突,但較小.

雌蜱:個(gè)體大小4.5 mm×3.0 mm(包括假頭).盾板近圓形,長(zhǎng)等于或稍大于寬,假頭基較短呈矩形,孔區(qū)較大呈卵圓形,前端向外斜置.盾板形狀近似心形,其琺瑯彩覆蓋不均勻.氣門板呈逗點(diǎn)形,背突窄短,背緣無明顯的幾丁質(zhì)增厚部.4對(duì)足粗細(xì)適中,第1對(duì)足基節(jié)內(nèi)外距近似相等,背距顯著突出,末端尖細(xì).第4對(duì)足基節(jié)外距末端超出該節(jié)后緣.如圖1所示為森林革蜱的正反雌雄腹面圖.

圖1 森林革蜱形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果Fig.1 Results of morphological identification of Dermacentor silvarum

2.2.2 嗜群血蜱形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 成蜱須肢第3節(jié)無背刺,腹刺短,足基節(jié)1內(nèi)距長(zhǎng)而尖,基節(jié)2～4內(nèi)距粗短,不超過后緣.雌蜱盾板近圓形.雄蜱盾板卵圓形,側(cè)溝明顯,前端伸達(dá)基節(jié)2水平,后緣達(dá)第一緣垛.如圖2.

圖2 嗜群血蜱形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果Fig.2 Results of morphological identification of Haemaphysalis conicinna

2.2.3 全溝硬蜱形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 體長(zhǎng)中等,未吸血個(gè)體約2.5～3.5 mm.假頭基腹面的耳狀突鈍齒形.第1對(duì)足基節(jié)具一細(xì)長(zhǎng)的內(nèi)距,雌蟲足基節(jié)Ⅰ內(nèi)距的末端達(dá)基節(jié)Ⅱ的前1/3,雄蟲的內(nèi)距略微超過基節(jié)Ⅱ前緣.雌蟲盾板橢圓形.雄蟲假頭基腹面后緣向后突出或圓角.如圖3.

圖3 全溝硬蜱形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果Fig.3 Results of morphological identification of Persulcatus ixodes

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.3.1 病原體的16S r DNA序列相似性分析 采用表2-2的引物對(duì)采集到的1 343只蜱針對(duì)10種病原體進(jìn)行PCR檢測(cè).結(jié)果發(fā)現(xiàn)在黑河地區(qū)的蜱類中存在立克次體感染的情況,PCR檢測(cè)得到300 bp左右的片段,將片段與p MD-18T載體鏈接得到382 bp片段,測(cè)序后的基因序列與NCBI進(jìn)行同源比對(duì)后發(fā)現(xiàn),該片段與斑點(diǎn)熱群中的勞氏立克次體病原體相似率最高,這種立克次體只在森林革蜱中被檢測(cè)到,在森林革蜱中的感染率分別為64.37%,隨機(jī)抽取150個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序后的基因序列提交GenBank獲得的登錄號(hào)為KC566999,具體種屬還要進(jìn)行下一步鑒定;其次還在黑河口岸的森林革蜱中均檢測(cè)到巴爾通體,感染率為3.35%,PCR檢測(cè)得到300 bp左右的片段,將片段與p MD-18T載體連接,經(jīng)測(cè)序后得到378 bp陽(yáng)性片段,進(jìn)行同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)與EF662053.1巴爾通體相似率達(dá)到了100%,提交GenBank獲登錄號(hào)為k M115550(citrate synthase(glt A)gene);在巴貝西蟲的檢測(cè)中,在黑河口岸的森林革蜱中檢測(cè)到一種類似巴貝西蟲病原體的DNA片段檢出率為1.70%,PCR檢測(cè)得到300 bp左右的片段,將片段與p MD-18T載體連接,經(jīng)測(cè)序后得到356 bp片段,進(jìn)行同源比對(duì),提交NCBI序列號(hào)KC567000,經(jīng)同源性比對(duì)后發(fā)現(xiàn)與(Xiphocephalus ellisi small subunit ribosomal RNA gene)FJ459762.1同源性最高達(dá)87%;而森林腦炎病毒、伯氏疏螺旋體、嗜吞噬細(xì)胞無形體、查菲埃立克體、土拉菌病、新布尼亞病毒及Q熱立克次體的的檢測(cè)結(jié)果均為陰性.結(jié)果見表4,表5.

表4 黑河市蜱的種類及病原體檢測(cè)情況Tab.4 Tick sampled and tick-borne pathogen detected in Heihe area,Heihe

表5 黑河市蜱的種類及病原體檢測(cè)情況Tab.5 Tick sampled and tick-borne pathogen detected in Heihe area,Heihe

2.3.2 PCR檢測(cè)結(jié)果 對(duì)采集自黑龍江省黑河口岸的1 343只蜱標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定,發(fā)現(xiàn)了立克次體、巴爾通體、類似巴貝西蟲均為陽(yáng)性,圖4、圖5、圖6為這3種病原體的特異性引物擴(kuò)增結(jié)果.

圖4 立克次體(屬)陽(yáng)性樣品PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 PCR detection for R.raoultii in D.silvarum

圖5 巴爾通體(屬)陽(yáng)性樣品PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.5 PCR detection for Bartonella sp.

圖6 類似巴貝西蟲陽(yáng)性樣品PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.6 PCR detection for Babesia-like in D.silvarum

3 討 論

黑河地區(qū)與俄羅斯只有一江之隔,境內(nèi)森林覆蓋率為58.5%,在這些邊境地區(qū)還有物種繁多的野生動(dòng)物以及珍貴的經(jīng)濟(jì)作物和藥材資源,因?yàn)橹参飫?dòng)物種類宿主多樣化,所以寄生的蜱蟲等媒介也存在多樣化,因此病原攜帶以及發(fā)病率也較高[8-9].隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,我國(guó)與國(guó)外的貿(mào)易往來以及旅游業(yè)的發(fā)展也越來越頻繁,黑河等地區(qū)作為我國(guó)北部的口岸,承擔(dān)著更大的貿(mào)易往來,因此我們要時(shí)時(shí)刻刻關(guān)注邊境的公共衛(wèi)生安全[10].本試驗(yàn)針對(duì)2012年至2014年的蜱蟲進(jìn)行分類,我們發(fā)現(xiàn)在一共采集的1 343只蜱蟲中,有一半以上的為森林革蜱,也就是說,在黑龍江省黑河地區(qū)靠近口岸的地區(qū)是很容易有森林革蜱的出現(xiàn)的,這種情況的產(chǎn)生是由于不同時(shí)間以及不同地點(diǎn)的環(huán)境、氣候及自然因素所導(dǎo)致的.其中全溝硬蜱和嗜群血蜱也占據(jù)了總數(shù)的一小部分,這也說明了在東北地區(qū)這樣四季分明,雨季周期也比較長(zhǎng)的天氣下,這3種蜱蟲為最重要的研究對(duì)象,我們不能忽視這一問題,就是這3種蜱蟲之間有著怎樣的聯(lián)系和互生性,另外,我們也將對(duì)這主要的3種蜱蟲進(jìn)行病原體的檢測(cè)和分析,并且通過簡(jiǎn)單科學(xué)的檢測(cè)方法進(jìn)行研究,為該地區(qū)的蜱蟲的種類和病原體傳染性進(jìn)行總結(jié)及評(píng)估,為我國(guó)的寄生蟲研究提供一定的參考資料.

研究發(fā)現(xiàn),在這3種蜱蟲中,森林革蜱1 054只,占總體構(gòu)成78.48%,為優(yōu)勢(shì)蜱種;嗜群血蜱236只,占總體構(gòu)成17.57%;全溝硬蜱53只,占總體構(gòu)成3.94%.我們也對(duì)森林革蜱進(jìn)行了病原體的檢查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在立克次體感染的情況,在森林革蜱中的感染率為64.37%,也就是說,立克次體的感染率已經(jīng)達(dá)到了一半以上.因此,在一定意義上講,森林革蜱仍然是監(jiān)測(cè)新發(fā)蜱媒傳染病的前哨種類,應(yīng)引起足夠重視.同時(shí),其他蜱種自然感染現(xiàn)象的存在,提示這些蜱媒傳染病原的生態(tài)復(fù)雜性.目前許多歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)開始重視這些蜱媒傳染病的監(jiān)測(cè)和預(yù)防工作,他們?cè)谶@項(xiàng)不容我們忽視的工作中做了大量的工作和投入.本研究PCR技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)立克次體、巴爾通體、巴貝西蟲,初步探討了他們攜帶病原體的情況,這為科學(xué)評(píng)估我國(guó)發(fā)生這些蜱媒傳染病的風(fēng)險(xiǎn)提供了科學(xué)依據(jù)和基礎(chǔ)支持.對(duì)于其他幾種蜱媒傳染病的人群流行情況還有待于進(jìn)一步研究.

我國(guó)至少存在10種立克次體病流行在不同蜱種中對(duì)埃立克次體和無形體的檢測(cè)方面,曹務(wù)春等在福建越原血蜱和卵形硬蜱中擴(kuò)增到查菲埃立克次體,陽(yáng)性率為55.2%,11.9%和12.0%.趙秋敏等從全溝硬蜱中分離到 HGA[11-12].高東旗等在內(nèi)蒙古森林革蜱、全溝硬蜱和新疆全溝硬蜱中分離到查菲埃立克次體,陽(yáng)性率為 39.1%,10.0%和 6.0%.在俄羅斯的諾沃西比爾斯克地區(qū)的邊緣革蜱及網(wǎng)紋革蜱中分離出這種新型的立克次體,2008年在俄羅斯與中俄口岸相鄰的Khabarovsk地區(qū)發(fā)現(xiàn)了立克次體病原體[13].在中國(guó)關(guān)于病原體的報(bào)道鮮有,2008年曹務(wù)春等在中國(guó)吉林地區(qū)的森林革蜱中發(fā)現(xiàn)了立克次病原體,2012年在西藏高原地區(qū)的西藏革蜱和銀盾革蜱發(fā)現(xiàn)了立克次病原體,黑龍江中俄口岸除黑河口岸以外這個(gè)病原體的流行還未見報(bào)道[14-15].