王圣元　肖楓林　李航

[摘要] 目的 分析自身免疫性調(diào)節(jié)因子（AIRE）在重癥肌無力（MG）患者外周血中的表達(dá)及其影響因素。 方法 收集2016年1月～2017年1月空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院收治的MG患者臨床資料及外周血標(biāo)本，分為全身型（GMG）組（16例）、眼肌型（OMG）組（14例）、對照組（10例）。采用流式細(xì)胞術(shù)分析各組AIRE因子、Tfr細(xì)胞及Tfh細(xì)胞比值。 結(jié)果 GMG組AIRE因子陽性表達(dá)較OMG組和對照組下降（P < 0.001），而OMG組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。AIRE因子陽性表達(dá)與Tfr/Tfh比值呈正相關(guān)（r=0.605，P < 0.001），而與QMG評分及臨床絕對評分均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.622，P < 0.001；r=-0.513，P=0.004）。 結(jié)論 AIRE可能參與了MG的發(fā)病過程，低水平AIRE在誘導(dǎo)MG發(fā)病的過程中可能起關(guān)鍵作用。

[關(guān)鍵詞] 自身免疫性調(diào)節(jié)因子；重癥肌無力；定量重癥肌無力評分；絕對評分

[中圖分類號] R746.1 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）05（a）-0047-04

The expression and influencing factors of AIRE in peripheral blood of myasthenia gravis

WANG Shengyuan1* XIAO Fenglin2* LI Hang1 ZHANG Yu1

1.Department of HBO， Navy General Hospital of PLA， Beijing 100048， China； 2.Department of Nephrology， Navy General Hospital of PLA， Beijing 100048， China

[Abstract] Objective To study the expression and influencing factors of AIRE in peripheral blood of MG. Methods Clinical data and peripheral blood samples of MG patients were collected at Tangdu Hospital of air force Military Medical University from January 2016 to January 2017. All data were divided into general type MG （GMG） group （16 cases）， ocular MG （OMG） group （14 cases） and control group （10 cases）. Flow cytometry was used to analyze the ratio of AIRE positive cells， Tfr cells and Tfh cells. Results The express of AIRE in GMG group was significantly lower than that in OMG group and control group （P=0.003）， but there was no significant difference between OMG group and control group （P=0.152）. The express of AIRE was positively correlated with the ratio of Tfr/Tfh （r=0.605， P < 0.001）， but negatively correlated with the QMG score and clinical absolute score （r=-0.622， P < 0.001； r=-0.513， P=0.004）. Conclusion AIRE may be involved in the pathogenesis of MG， and low level of AIRE may play a key role in the pathogenesis of MG.

[Key words] Autoimmune regulator； Myasthenia gravis； Quantitative MG score； Clinical absolute score

重癥肌無力（MG）是神經(jīng)系統(tǒng)常見的自身免疫系統(tǒng)疾?。ˋIDs），具有明確的抗原、抗體及病理作用靶點，病變累及神經(jīng)-肌肉接頭突觸后膜上的乙酰膽堿受體[1-2]。MG發(fā)病機制與異常的免疫應(yīng)答明顯相關(guān)，但引起MG起病或加重的機制仍不明確[3]。

免疫性調(diào)節(jié)因子（AIRE）是一種轉(zhuǎn)錄因子，由胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞亞群產(chǎn)生，可以選擇性的對自我耐受的T細(xì)胞受體表現(xiàn)出極高的親和性并促使后者進入凋亡，避免了自身免疫的發(fā)生[4]。大量動物實驗揭示出AIRE突變對獲得性免疫缺陷綜合征（AIDs）的易感性之間的聯(lián)系，AIRE基因敲除小鼠與野生型小鼠比較對包括MG在內(nèi)的多種AIDs易感[5]，表明AIRE表達(dá)對于AIDs發(fā)病起到關(guān)鍵作用。本研究擬對比AIRE在不同MG患者間的表達(dá)，試圖分析AIRE的表達(dá)與患者基本情況、病情嚴(yán)重程度及Tfh細(xì)胞、Tfr細(xì)胞之間的關(guān)系，為進一步研究MG發(fā)病機制提供思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月～2017年1月就診于空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院門診的MG患者，對患者進行臨床QMG評分及絕對評分并收集外周血標(biāo)本，共入組患者30例，根據(jù)Osserman分型分為全身型MG（GMG組）患者16例，眼肌型MG（OMG組）患者14例；同期選取健康對照組10例。所得數(shù)據(jù)中男24例，女16例，發(fā)病年齡20～66歲，平均（42.08±14.20）歲。各組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；MG組患者中臨床QMG評分3～27分，平均（10.97±6.28）分；絕對評分2～31分，平均（13.47±6.42）分。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，受試者知情同意并簽署知情同意書。

參考中國MG診斷和治療指南（2015年版）制定入組標(biāo)準(zhǔn)：①骨骼肌易疲勞，表現(xiàn)為波動性及易疲勞性；呈晨輕暮重。②新斯的明試驗陽性。③肌電圖低頻刺激波幅遞減10%以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①3個月內(nèi)曾接受免疫抑制劑治療；②3個月內(nèi)曾接受免疫球蛋白或血漿置換治療；③合并其他AIDs。

1.2 方法

1.2.1 臨床QMG評分及絕對評分 定量MG評分量表由1983年提出，后由Tindall等[6]進行修正并擴展至13個項目，美國重癥肌無力協(xié)會推薦QMG評分用于所有與MG相關(guān)的臨床研究，總分0～39分；臨床絕對評分由我國專家于1997年提出并應(yīng)用臨床，被國內(nèi)MG治療的專家共識及治療指南收錄，總分0～60分，分?jǐn)?shù)越高提示MG病情越重。

1.2.2 采用密度離心法分離外周血PBMCs 將3 mL血樣本與等量1640培養(yǎng)基（HyClone公司）充分混和，加入人外周血淋巴細(xì)胞分離液3 mL，使用離心機（貝克曼Allegra X-22R）在4℃下2000 r/m離心20 min；離心后吸出云霧層，即PBMCs層，加入5倍體積RMPI-1640溶液重懸洗滌細(xì)胞2次，保留黏附在離心管底部的PBMCs。將待測細(xì)胞加入抗人CD4抗體（Biolegend公司）和抗人CXCR5抗體（Biolegend公司）與細(xì)胞懸液充分混勻，避光孵育30 min；洗滌細(xì)胞2次后保留黏附在離心管底部的細(xì)胞。避光情況下加入1 mL固定/破膜液（Miltenyi公司）重懸，避光30 min進行細(xì)胞破膜，洗滌并重懸細(xì)胞后加入抗人AIRE抗體（Miltenyi公司）和抗鼠/人Foxp3抗體（Biolegend公司）避光孵育30 min；避光加入2%多聚甲醛500 μL固定細(xì)胞。采用FACS Calibur流式細(xì)胞分析儀（BD公司），進行流式分析。需要分析：AIRE陽性細(xì)胞占比，CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr細(xì)胞占比，CD4+CXCR5+Foxp3-Tfh細(xì)胞占比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗；采用相關(guān)檢驗Spearman檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組間AIRE表達(dá)的差異

流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果示意圖見圖1A。三組AIRE陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.571，P < 0.01）；AIRE因子陽性表達(dá)率GMG組[（76.25±12.73）%]較OMG組[（84.30±6.13）%]和對照組[（89.98±3.56）%]明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.001），而AIRE表達(dá)在OMG組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）（圖1B）。

2.2 AIRE表達(dá)與Tfr細(xì)胞、Tfh細(xì)胞的相關(guān)性分析

細(xì)胞流式結(jié)果顯示Tfr細(xì)胞、Tfh細(xì)胞及兩者的比值見表1，AIRE因子陽性表達(dá)與Tfr/Tfh比值呈正相關(guān)（r=0.605，P < 0.001），見圖2。

2.3 AIRE表達(dá)與病情嚴(yán)重程度、年齡、性別等相關(guān)性分析

所有30例MG患者AIRE因子陽性表達(dá)與QMG評分[（10.97±6.28）分]及絕對評分[（13.47±6.42）分]均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.622，P < 0.001；r=-0.513，P=0.004）（圖2A、B）。為了排除干擾因素，進行了AIRE因子陽性表達(dá)與年齡之間相關(guān)性分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（r=-0.004，P=0.983）（圖2C）。比較不同性別間的AIRE因子陽性表達(dá)[男性（82.37±11.26）%，女性（82.69±9.76）%]，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.093，P=0.926）（圖2D）。

3 討論

AIRE主要存在于胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞，屬于陰性選擇系統(tǒng)，作為促凋亡因子，對存在自身抗原-抗體表現(xiàn)的T細(xì)胞加快其凋亡，從而阻止自反應(yīng)克隆的逃逸，在免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用[7-8]，而AIRE在外周血的作用主要是參與對抗原的識別，并通過對抗原進行修飾及遞呈維護免疫系統(tǒng)的相對穩(wěn)定[9]。結(jié)合本實驗結(jié)果，GMG組的AIRE表達(dá)明顯低于OMG組和對照組，而OMG組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，OMG患者因僅累計眼外肌群，其病情嚴(yán)重程度較GMG患者明顯減輕，并且AIRE在排除干擾因素后與MG患者病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，提示AIRE的下降與MG發(fā)病有一定的聯(lián)系，低水平AIRE在誘導(dǎo)MG發(fā)病的過程中可能起關(guān)鍵作用。

本研究發(fā)現(xiàn)AIRE因子陽性表達(dá)與Tfr/Tfh比值呈正相關(guān)。目前研究認(rèn)為，MG發(fā)病機制與異常免疫應(yīng)答相關(guān)，并且體液免疫在MG發(fā)病、發(fā)展過程中起了十分重要的作用，B細(xì)胞的失調(diào)及分泌的抗體可能直接或間接導(dǎo)致了MG發(fā)病，但其具體的機制還不明[10]。Tfh細(xì)胞是輔助B細(xì)胞的重要細(xì)胞群，可通過相應(yīng)的受體與B細(xì)胞牢固結(jié)合[11]，在促使B細(xì)胞增殖、分化等重要轉(zhuǎn)變過程中起到十分重要的作用[12]。同時，Tfh細(xì)胞通過分泌IL-21協(xié)助B細(xì)胞的成熟過程，并產(chǎn)生大量的抗體[13]。Tfh細(xì)胞可通過細(xì)胞因子遷徙至外周組織而發(fā)揮作用，并不斷通過級聯(lián)反應(yīng)增強B細(xì)胞的遷徙及過度強化，從而加強異常免疫反應(yīng)[14]。同樣動物研究發(fā)現(xiàn)，如果對實驗小鼠進行免疫耐受使B細(xì)胞缺失，或阻斷抗原呈遞的過程，即便小鼠體內(nèi)存在大量自反應(yīng)細(xì)胞，Tfh細(xì)胞占比仍不上升[15]?？梢夿細(xì)胞與Tfh細(xì)胞之間可能存在重要調(diào)控機制，這一過程可能有AIRE的調(diào)控作用[16]。

Tfr細(xì)胞是Treg細(xì)胞的特殊亞群，對Tfh細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞活化產(chǎn)生拮抗作用[17]，進一步抵制抗體的產(chǎn)生[18]。Tfr細(xì)胞具有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及Tfh細(xì)胞的雙重特征[19]，可通過直接或間接作用與B細(xì)胞發(fā)生關(guān)聯(lián)，在Tfr細(xì)胞數(shù)量下降或功能降低時，Tfh細(xì)胞表達(dá)可上調(diào)，并使B細(xì)胞的數(shù)量上升。可見，Tfr細(xì)胞可限制Tfh細(xì)胞對免疫調(diào)節(jié)的部分功能，從而避免B細(xì)胞過度表達(dá)、增殖及遷徙，保持細(xì)胞免疫的平衡。任何異?；驘o序Tfr/Tfh比值，都會破壞這種平衡，導(dǎo)致免疫功能紊亂，使B細(xì)胞產(chǎn)生過度的抗體，其結(jié)果是MG的發(fā)病、發(fā)展。

AIRE對MG發(fā)病的影響機制可能較多，但主要機制是在對自反應(yīng)細(xì)胞的清除，在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定的管理上[20]。AIRE和Tfh、Tfr細(xì)胞之間可能存在相互作用的機制，使T細(xì)胞及B細(xì)胞功能相繼出現(xiàn)紊亂，逐漸形成惡性循環(huán)，進一步促使免疫功能發(fā)生紊亂，從而引起MG發(fā)病。

[參考文獻]

[1] Wolfe GI，Kaminski HJ，Aban IB，et al. Randomized Trial of Thymectomy in Myasthenia Gravis [J]. Med，2016，375（6）：511-522.

[2] Richards J，Howard JF. Seronegative myasthenia gravis associated with malignant thymoma [J]. Neuromuscul Disord，2017，27（5）：417-418.

[3] 汪杰，李宏增，李川，等.重癥肌無力患者的免疫指標(biāo)與臨床療效分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2016，16（31）：6162-6191.

[4] 閆斌，朱明振，李衛(wèi)君，等.自身免疫調(diào)節(jié)因子在重癥肌無力患者胸腺內(nèi)的表達(dá)及作用分析[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2017，34（10）：913-915.

[5] Berrih-Aknin S. Myasthenia Gravis：Paradox versus paradigm in autoimmunity [J]. J Autoimmun，2014，52：1-28.

[6] Tindall RS，Rollins JA. Preliminary results of a double-blind， randomized，placebocontrolled trial of cyclosporine in myasthenia gravis [J]. N Engl J Med，1987，316（12）：719-724.

[7] Zhang X，Ding XJ，Wang Q，et al. polymorphism in autoimmune regulator（AIRE） gene is associated with susceptibility of myasthenia gravis in Chinese patients [J]. Clin Neu？鄄rosci，2017，40（6）：180-184.

[8] Pezzi N，Assis AF，Cotrim-Sousa LC，et al. Aire knockdown in medullary thymic epithelial cells affects Aire protein，deregulates cell adhesion genes and decreases thymocyte interaction [J]. Molecular Immunol，2016，77：157-173.

[9] Perniola R，Musco G. The biophysical and biochemical properties of the autoimmune regulator （AIRE） protein [J]. Biochim Biophys Act，2014，1842（2）：326-337.

[10] Guptill JT，Yi JS，Sanders DB，et al. Characterization of B cells in muscle-specific kinase antibody myasthenia gravis [J]. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm，2015， 26，2（2）：e77.

[11] Li D，Li H，F(xiàn)u H，et al. Aire-Overexpressing Dendritic Cells Induce Peripheral CD4+ T Cell Tolerance [J]. Int J Molecul Sci，2016，17（1）：38.

[12] Zhu J，Paul WE. Heterogeneity and plasticity of T helper cells [J]. Cell Res，2010，20（1）：4-12.

[13] 金伯泉.T-B細(xì)胞協(xié)作研究的重大突破——濾泡輔助性T細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，一個新的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞亞群[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2009，25：1-5.

[14] Zhu Y，Zou L Liu Y. T follicular helper cells，T follicular regulatory cells and autoimmunity [J]. Int Immunol，2016， 28（4）：173-179.

[15] Poholek AC，Hansen K，Hernandez SG，et al. In vivo regulation of Bcl6 and T follicular helper cell development [J]. J Immunol，2010，185：313-326.

[16] Deenick EK，Ma CS，Brink R，et al. Regulat ion of T follicular helper cell formation and function by antigen presenting cells [J]. Curr Opin Immunol，2011，23（1）：111-118.

[17] Lin J，Yang L，Silva HM，et al. Increased generation of Foxp3 （+） regulatory T cells by manipulating antigen pre？鄄sentation in the thymus [J]. Nat Commun，2016，7：10562.

[18] Malchow S，Leventhal DS，Lee V，et al. Aire Enforces Immune Tolerance by Directing Autoreactive T Cells into the Regulatory T Cell Lineage [J]. Immunity，2016，44（5）：1102-1113.

[19] Sage PTT，Sharpe AH. T follicular regulatory cells [J]. Immunol Rev，2016，271（1）：246-259.

[20] Abramson J，Husebye ES. Autoimmune regulator and self-tolerance-molecular and clinical aspects [J]. Immunol Rev，2016，271（1）：127-140.

（收稿日期：2018-02-01 本文編輯：任 念）