劉小艷　嚴(yán)德萍　陳建鳴

【摘要】 目的：通過改良Pulsinelli四血管夾閉法制備大鼠腦缺血模型，為腦卒中的研究提供有效的動(dòng)物模型。方法：實(shí)驗(yàn)選用健康成年雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組和缺血模型組，自由飲食。術(shù)前禁食過夜，用水合氯醛麻醉（40 mg/100 g，腹腔注射），將大鼠固定于操作臺(tái)上。沿第一頸椎內(nèi)斜向上的神經(jīng)來尋找翼突孔，用尖端細(xì)長的電烙鐵電凝雙側(cè)翼小孔下方的椎動(dòng)脈，縫合皮膚。頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線并縫合皮膚，夜間禁食。次日，用動(dòng)脈夾夾閉清醒大鼠的雙側(cè)頸總動(dòng)脈15 min，造成短暫前腦缺血。假手術(shù)組中除不電凝椎動(dòng)脈和不夾閉頸總動(dòng)脈外，其他操作與模型組相同。對(duì)照組不做任何處理。結(jié)果：大鼠造模成功43只，成功率為66.2%，模型成功后存活40只，存活率為93.0%。尼氏染色顯示，對(duì)照組大鼠與假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列緊密整齊，結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核圓而規(guī)則。缺血模型組大鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，大量錐體神經(jīng)元變性壞死，細(xì)胞核不規(guī)則并固縮深染，細(xì)胞間隙明顯增大。結(jié)論：改良的Pulsinelli四血管夾閉法可以制備理想的大鼠腦缺血模型，成功率高，適合缺血性腦卒中的實(shí)驗(yàn)研究。

【關(guān)鍵詞】 腦卒中； 動(dòng)物模型； Pulsinelli四血管夾閉法； 大鼠

Establishment of Cerebral Ischemia Model in Rats by Modified Pulsinelli Four-vessel Occlusion Method/LIU Xiaoyan，YAN Deping，CHEN Jianming，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（14）：029-032

【Abstract】 Objective：To establish a rat model of transient cerebral ischemiaby a modified Pulsinelli four-vessel occlusion method，which provided an effective animal model for the study of stroke.Method：Adult male Wistar rats were randomly divided into control group，sham operation group and ischemic group，free diet.Rats were fasted overnight and anesthetized with chloral hydrate（40 mg/100 g，i.p.），the rats were fixed on the console.Along the first cervical vertebra oblique nerve to find the wing protruding hole，bilateral vertebral artery below the pinhole were electro-coagulatedwith a sharp slender，and sutured the skin.The common carotid arterieswere separated，and rats were fasted at night.The next day，the common carotid artery was clamped for 15 min，resulting in transient forebrain ischemia.In the sham operation group，except the non-occlusion vertebral artery and the common carotid artery，the other operations were the same as the model group. The control group did not do any treatment.Result：Ischemic model were successfully established in 43 rats，with a success rate of 66.2% and 40 surviving after a successful model，the survival rate was 93.0%.Nissl staining showed that neurons in hippocampal CA1 region of rats in control group and sham operation group were arranged closely and neatly， with normal structure and regular nuclei.The number of normal neurons in hippocampal CA1 area of ischemic model group was significantly reduced.A large number of pyramidal neurons degenerated and necrotic，the nucleus was irregular and contracted deeply，and the intercellular space was significantly increased.Conclusion：The modified Pulsinelli four-vessel occlusion method can be used to establish an ideal model of cerebral ischemia in rats with high success rate and suitable for the experimental study of ischemic stroke.

【Key words】 Stroke； Animal model； Pulsinelli four-vessel occlusion； Rat

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.14.007

缺血性腦卒中是由于向腦組織提供血液的血管突然破裂或因血管阻塞導(dǎo)致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一種疾病，頸內(nèi)動(dòng)脈和椎動(dòng)脈閉塞可引起缺血性腦卒中[1]。腦卒中已成為我國第一位死亡原因，也是中國成年人殘疾的首要原因，具有發(fā)病率高、死亡率高和致殘率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類健康和生活，至今沒有很好的治療方法[2-3]。在缺血性腦血管病的基礎(chǔ)研究中，建立穩(wěn)定、可靠及操作簡(jiǎn)便的動(dòng)物模型是開展各項(xiàng)研究的基礎(chǔ)[4]，也是評(píng)價(jià)不同的治療方法所必需的[5]。目前公認(rèn)的Pulsinelli大鼠前腦缺血四血管模型是研究多種缺血性腦疾病經(jīng)典模型之一。大鼠四血管閉塞可引起嚴(yán)重的前腦缺血，但不影響腦干生命中樞的血液供應(yīng)，其血液供應(yīng)基本不減少，為正常灌注的96.31%[6]。而且該方法可較好地模擬臨床上因低血壓休克、心肺腦復(fù)蘇等造成的前腦缺血性損傷過程。因此，近年來經(jīng)典的Pulsinelli四血管夾閉法被許多學(xué)者所使用[7]。尼氏染色法是評(píng)價(jià)改良的Pulsinelli四血管夾閉法是否能成功建立大鼠腦缺血模型的常用方法。尼氏體是胞質(zhì)內(nèi)的一種嗜堿性物質(zhì)，廣泛見于各種神經(jīng)元。在尼氏染色中尼氏體清晰可辨，尼氏體受染后呈塊狀或顆粒狀。生理情況下，尼氏體大而數(shù)量多；神經(jīng)元受損時(shí)，尼氏體數(shù)量可減少甚至消失。短暫腦缺血會(huì)誘發(fā)神經(jīng)損傷，特別是在大鼠海馬的CA1區(qū)尼氏體數(shù)量顯著減少[5]。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康成年雄性Wistar大鼠85只，體重200～250 g。由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于12 h晝夜循環(huán)的安靜的環(huán)境中，室溫為（23±2）℃，濕度為（60±10）%，每組分籠飼養(yǎng)，每籠放2只，術(shù)前適應(yīng)新環(huán)境1周，自由攝食飲水。將大鼠標(biāo)號(hào)后通過隨機(jī)數(shù)字表分為對(duì)照組（10只）、假手術(shù)組（10只）和腦缺血模型組（65只）。

1.2 模型制作方法 模型組用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的水合氯醛（生產(chǎn)廠家：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：Q/12HB 4218-2009）進(jìn)行腹腔麻醉（1 mL/100 g）[8]，將大鼠俯臥固定于操作臺(tái)上，頭向下傾斜與平面呈大約30°[9]，頸后備皮，消毒，于枕部第一頸椎水平處做一個(gè)1～2 cm的縱向切口，分離筋膜和肌肉，以第一頸椎上穿出的神經(jīng)為標(biāo)志，暴露第一頸椎翼突孔[10]，用電烙鐵燒灼雙側(cè)椎動(dòng)脈4～5次，4～5 s/次，縫合切口，消毒。將大鼠仰臥固定于操作臺(tái)上，頸前部位備皮，消毒，頸前正中部位做一個(gè)1.0～1.5 cm的縱切口，在氣管兩側(cè)仔細(xì)分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈約1 cm，穿線以備次日用。術(shù)后青霉素（生產(chǎn)廠家：華北制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H13020656）用4 mL 0.9%氯化鈉溶液溶解后取0.2 mL給大鼠腹腔注射防止感染。24 h后，把完全清醒的大鼠用合適的手法固定，消毒，拆開頸部縫合線，提起頸總動(dòng)脈下的備用線，用微創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈。夾閉15 min后放開動(dòng)脈夾，恢復(fù)血液供應(yīng)，縫合切口。術(shù)后將大鼠放在干凈的籠中單獨(dú)飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不電凝椎動(dòng)脈和不夾閉頸總動(dòng)脈外，其他操作與模型組相同。對(duì)照組不做任何處理。造模時(shí)觀察電凝椎動(dòng)脈的最佳部位，夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈后觀察大鼠的意識(shí)狀態(tài)、瞳孔大小、對(duì)光反射和翻正反射。

1.3 觀察指標(biāo)與判斷標(biāo)準(zhǔn) 觀察缺血損傷后腦組織的病理組織學(xué)改變。（1）取材及病理學(xué)檢查。7 d后大鼠經(jīng)腹腔麻醉后開胸暴露心臟，經(jīng)升主動(dòng)脈插管，用200 mL 4 ℃生理鹽水心臟灌注沖洗血液后立即更換4%的多聚甲醛300 mL先快后慢，待大鼠僵硬，肝肺泛白后，立即斷頭取全腦組織浸入多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定24 h，用30%的蔗糖脫水，之后作冠狀面冰凍切片，尼氏染色觀察海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的結(jié)構(gòu)變化。（2）模型成功指征。腦缺血模型制作成功的標(biāo)準(zhǔn)是：在夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈后大鼠在30～60 s內(nèi)昏迷，意識(shí)喪失，翻正反射消失，雙眼球蒼白，雙側(cè)瞳孔放大且對(duì)光反射消失，能自主呼吸。在夾閉15 min內(nèi)上述反應(yīng)均未恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)過程中凡不符合上述標(biāo)準(zhǔn)或大鼠出現(xiàn)抽搐及死亡視為失敗。偏癱和癲癇的大鼠排除進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)[10]。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存情況 大鼠模型組65只，造模成功43只，成功率為66.2%，模型成功后存活40只，存活率為93.0%。

2.2 組織學(xué)檢查 尼氏染色顯示，與假手術(shù)組相比，腦缺血模型組大鼠海馬腦區(qū)中CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，CA3區(qū)神經(jīng)元無明顯變化（圖1）。假手術(shù)組CA1區(qū)神經(jīng)元排列緊密整齊，結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核圓而規(guī)則，核膜清楚，有明顯的核仁，核膜境界清楚；腦缺血模型組大鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，大量錐體神經(jīng)元變性壞死，細(xì)胞核不規(guī)則并固縮深染，細(xì)胞間隙明顯增大，胞漿呈空泡樣變（圖2）。

3 討論

四血管阻塞法是前腦缺血模型常用的制作方法，在1979年P(guān)ulsinelli和Brierley首次利用四血管閉塞法成功建立了大鼠前腦缺血再灌注模型，利用四血管阻塞法制作大鼠前腦缺血再灌注模型的解剖學(xué)基礎(chǔ)在于：大鼠腹側(cè)的脊髓動(dòng)脈具有一個(gè)走向腦干的返支，四血管閉塞期間可維持腦干的血液供應(yīng)，使動(dòng)物得以存活[11]。嚙齒動(dòng)物的大腦血管和人類的大腦血管解剖特征非常相似，因此嚙齒動(dòng)物常被用于腦缺血實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭衃12]。

經(jīng)典的Pulsinelli電凝椎動(dòng)脈后4 d分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，實(shí)驗(yàn)周期長，易造成大鼠缺血缺水死亡。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過改良的手術(shù)方法：燒灼大鼠第一頸椎上雙側(cè)翼孔，閉塞雙側(cè)椎動(dòng)脈。分離雙側(cè)頸動(dòng)脈；動(dòng)物存活24 h后，在清醒狀態(tài)下夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，造成前腦缺血。因該方法缺血效果確切，模型重復(fù)性及可比性較強(qiáng)而被廣泛應(yīng)用。本方法的優(yōu)點(diǎn)在于：（1）斜背向頭側(cè)燒灼閉塞雙側(cè)椎動(dòng)脈，一方面是由翼突孔的生理形態(tài)決定，也可以避免造成局部產(chǎn)熱過高而損傷脊髓和腦干[13]。（2）燒灼最佳時(shí)間：4～5 s/次，每側(cè)燒灼4～5次。（3）術(shù)后護(hù)理大鼠。術(shù)后大鼠身體狀況較差，加上缺血再灌注對(duì)腦的損傷，因此對(duì)大鼠的護(hù)理也是影響模型成功率的因素之一，定時(shí)給其清洗眼睛，暢通呼吸道，避免傷口感染[14]。另外，相同的操作方法用不同的操作者和不同的固定及放松大鼠手法也能改變大鼠四血管閉塞的程度反應(yīng)[9]。這種造模方法成功率很高，不需要準(zhǔn)備大量動(dòng)物，缺血性神經(jīng)元損傷大，癲癇的發(fā)生率低[10]。也可以避免造成大鼠大腦缺血的其他方法引起的并發(fā)癥，可以出現(xiàn)在文獻(xiàn)中組織病理學(xué)中描述的前腦缺血的特征[15]。

前腦缺血模型對(duì)于人類卒中的研究是必須的，然而不可視的電凝椎動(dòng)脈的方法可造成不完全的閉塞，使模型失敗[16]。也存在操作復(fù)雜、椎動(dòng)脈阻斷困難、術(shù)中死亡等缺點(diǎn)。椎動(dòng)脈為大鼠大腦提供充足的血流，若大鼠沒有完全昏迷或者反應(yīng)靈敏，表明椎動(dòng)脈沒有完全閉塞[9]。有些大鼠存在變異，第一頸椎上的翼孔開口較小或缺失，或存在兩個(gè)開口。若直接燒灼，往往不能完全閉塞椎動(dòng)脈。夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈后，通過觀察大鼠神經(jīng)體征的改變作為判定達(dá)到前腦缺血的標(biāo)準(zhǔn)，易受觀察者主觀因素的影響，因此需要在組織學(xué)水平最終確定缺血效果[11]。實(shí)驗(yàn)組織病理學(xué)的變化證明筆者采用的前腦缺血再灌注損傷大鼠模型是成功的。

本研究中仍使用液體麻藥，在以后實(shí)驗(yàn)中可以在全程乙醚麻醉下操作的方法，避免麻藥的使用[10]；缺血大鼠顯示梗死面積增加，可用腦核磁來檢驗(yàn)和篩選最佳模型；缺血大鼠也顯示大鼠習(xí)慣化減弱，焦慮和自主活動(dòng)增加，可用高架十字迷宮等測(cè)大鼠行為[17]；大鼠模型成功后缺血造成大鼠始終不變的體位變化。大鼠大腦損傷的兩半球?qū)ΨQ性和強(qiáng)度與體位改變的出現(xiàn)和維持以及維持時(shí)間有關(guān)[15]?？赏ㄟ^觀察其體位變化辨別模型成功率的高低。

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（收稿日期：2017-12-25） （本文編輯：張爽）