張偉強(qiáng) 陳 晨 周琳琳 潘 軍 胡江春 薛德林 ，*

1 廣州博善生物科技股份有限公司 廣州 116222

2 中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所 沈陽(yáng) 110016

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是能夠產(chǎn)生芽孢的兼性好氧微生物，在分類學(xué)上屬原核生物、真細(xì)菌[1]，主要分布在海洋、江河、湖泊、活性污泥和土壤中[2]。因枯草芽孢桿菌具有生物奪氧、抑制病菌、生物拮抗、調(diào)整菌群等功能，從而促進(jìn)有益厭氧菌生長(zhǎng)，故其在提高動(dòng)物機(jī)體免疫力、增強(qiáng)消化系統(tǒng)酶活性、防病治病和促進(jìn)生長(zhǎng)中起到了重要作用[3]。枯草芽孢桿菌菌體繁殖速度快，容易培養(yǎng)，能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多種氨基酸，產(chǎn)品適用范圍廣泛。腐植酸鈉是以礦源腐植酸為原料經(jīng)特殊工藝加工制成的一種具有多種功能的大分子有機(jī)弱酸鈉鹽，應(yīng)用到畜禽養(yǎng)殖中，具有抗菌、抗病毒、收斂和消炎作用，能提高畜禽免疫力、促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)、增加飼料轉(zhuǎn)化率，同時(shí)在醫(yī)藥、環(huán)保、工業(yè)等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[4～10]。

枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉是以枯草芽孢桿菌BS18為出發(fā)菌株，發(fā)酵后以腐植酸鈉為吸附載體，經(jīng)低溫氣流干燥，精制而成。本文將枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉應(yīng)用于保育豬、小豬、中豬和育肥豬的試驗(yàn)研究中，以期為枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌劑在豬養(yǎng)殖上的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

枯草芽孢桿菌BS18菌株，從遼寧大連黃海海域（東經(jīng)122°21′，北緯39°34′）的底泥中分離得到，具有生物活性高、抑菌效果好、抗逆性強(qiáng)、抗高溫、抗酸堿、抗擠壓等優(yōu)點(diǎn)，并能作為模式菌株在生物芯片上進(jìn)行有效的DNA擴(kuò)增和蛋白質(zhì)、氨基酸分離的優(yōu)良菌株[2，6]。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)基（菌種培養(yǎng)）：葡萄糖1.0%、蛋白胨1.0%、牛肉膏0.5%、氯化鈉0.1%、硫酸鎂0.05%、磷酸氫二鉀0.1%、瓊脂2.0%、余量為純凈水，pH 7.0～7.2；滅菌條件：0.08 MPa、118 ℃蒸氣滅菌（18 min）；培養(yǎng)條件：溫度30 ℃、時(shí)間48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基（增殖培養(yǎng)）：葡萄糖1.0%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、玉米面1.0%、豆粕1.0%、硫酸銨0.1%、氯化鈉0.1%、硫酸鎂0.05%、磷酸氫二鉀0.1%、余量為純凈水，pH 7.0～7.2；發(fā)酵罐裝液量為70%，接種量5%；滅菌條件：0.08 MPa、121 ℃蒸氣滅菌（20 min）；培養(yǎng)條件：罐壓0.05 MPa、通氣量100～120 vvm、轉(zhuǎn)速200 rpm、溫度30 ℃、時(shí)間48 h。

1.3 供試材料與性質(zhì)

腐植酸鈉：顆粒度≤200目、pH值≥8、水溶性腐植酸含量（干基）≥70%、Fe含量≤0.45%、水分含量≤15%，外觀呈黑亮色，由新疆雙龍腐植酸有限公司提供。

1.4 枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉的生產(chǎn)

將發(fā)酵好的每毫升含活菌數(shù)≥200個(gè)億的種子液，按照100∶38的比例，與腐植酸鈉混合，放置到固體發(fā)酵器中，溫度38 ℃，發(fā)酵溫度控制在50 ℃以下，保溫發(fā)酵68 h，再通入無(wú)菌風(fēng)降溫，經(jīng)氣流干燥，降低含水量，使枯草芽孢桿菌BS18變成芽孢，含水量≤10%，粉碎到200目以下，測(cè)定芽孢數(shù)，每克含活菌數(shù)≥200個(gè)億為合格產(chǎn)品，得到枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉。

1.5 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

1.5.1 試驗(yàn)時(shí)間

保育豬：2015年5月6日—31日，試驗(yàn)期為25天；小豬：2015年6月10日—7月15日，試驗(yàn)期為35天；中豬：2015年8月1日—9月5日，試驗(yàn)期為35天；育肥豬：2015年9月25日—10月30日，試驗(yàn)期為35天。

1.5.2 試驗(yàn)地點(diǎn)

大連嘉明農(nóng)牧生物科技有限公司豬場(chǎng)。

1.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)布置：試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2、對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)，共設(shè)置9個(gè)養(yǎng)殖豬圈，養(yǎng)殖豬圈面積為長(zhǎng)×寬＝6 m×6 m＝36 m2，隨機(jī)排列。

試驗(yàn)組1：飼料中添加0.2%枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉[2]，拌料混勻；試驗(yàn)組2：飼料中添加0.5%枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉，拌料混勻；對(duì)照組：飼料中不添加枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉。

1.7 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)前對(duì)試驗(yàn)欄進(jìn)行全面清洗消毒，試驗(yàn)豬選擇同批次轉(zhuǎn)群、均勻、健康的試驗(yàn)豬；試驗(yàn)正式開(kāi)始前要對(duì)豬群進(jìn)行預(yù)飼，預(yù)飼后再根據(jù)采食量和欄均量進(jìn)行分組，在欄舍進(jìn)行標(biāo)注。試驗(yàn)期間通風(fēng)保暖，保持欄舍清潔，自由飲水、自由采食，每天早晚各填料一次。試驗(yàn)期間記錄試驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的病、殘、死、淘情況；當(dāng)欄內(nèi)發(fā)生有死淘豬現(xiàn)象時(shí)，當(dāng)日應(yīng)清槽統(tǒng)計(jì)欄總飼喂量，階段計(jì)算死淘豬所消耗的飼料量。

1.8 測(cè)定指標(biāo)及方法

試驗(yàn)開(kāi)始、結(jié)束時(shí)對(duì)試驗(yàn)豬群進(jìn)行空腹稱重，記錄始重、末重，并且在試驗(yàn)期間記錄每天投料量，統(tǒng)計(jì)腹瀉頭數(shù)；試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算日增重、日采食量和腹瀉指數(shù)；觀察記錄試驗(yàn)豬皮膚和毛色狀況。

（1）平均每頭日采食量：試驗(yàn)期內(nèi)總采食的飼料重量/試驗(yàn)天數(shù)/試驗(yàn)頭數(shù)。

（2）平均每頭日增重：試驗(yàn)期內(nèi)每頭增加的體重/試驗(yàn)天數(shù)。

（3）料重比（飼料利用率）：試驗(yàn)期間消耗的飼料量與增重之比。

（4）腹瀉指數(shù)：發(fā)現(xiàn)腹瀉病豬后為該豬作標(biāo)記號(hào)，跟蹤記錄發(fā)病日期、持續(xù)時(shí)間、康復(fù)情況；嚴(yán)重發(fā)病要剔除試驗(yàn)欄，并稱取病豬的體重，做好日期和體重的記錄。根據(jù)評(píng)分[11]結(jié)果（0分：糞便條狀或粒狀；1分：軟糞、能成形；2分：稠狀、不成形、糞水未分離；3分：液狀、不成形、糞水分離）計(jì)算每欄腹瀉指數(shù)，其計(jì)算公式為：每欄腹瀉指數(shù)=觀察記錄分?jǐn)?shù)總和/（觀察總天數(shù)×欄總頭數(shù)）×100%。

（5）死淘豬飼料量的扣除計(jì)算：（死淘豬所在欄總飼喂量-死淘日清槽料量）/欄總頭數(shù)×死淘豬試驗(yàn)天數(shù)。

（6）成活率：試驗(yàn)結(jié)束總頭數(shù)/試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)總頭數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉對(duì)保育

豬生長(zhǎng)性能的影響

將枯草芽孢桿菌腐植酸鈉型菌粉，在保育豬階段日糧中按照0.2%和0.5%進(jìn)行添加，經(jīng)過(guò)25天的喂養(yǎng)試驗(yàn)，其對(duì)保育豬生長(zhǎng)性能的影響結(jié)果如表1所示。

表1 枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉對(duì)保育豬階段生長(zhǎng)性能的影響Tab.1 Effects of sodium humate-type Bacillus subtilis BS18 on weaned pigs growth performance

通過(guò)表1可知：試驗(yàn)組1平均每頭日增重0.496 kg，試驗(yàn)組2平均每頭日增重0.480 kg，對(duì)照組平均每頭日增重0.452 kg，試驗(yàn)組1比對(duì)照組每頭平均日增重提高9.73%，試驗(yàn)組2比對(duì)照組平均每頭日增重提高6.19%，兩個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組間差異顯著；試驗(yàn)組1料重比為1.352，試驗(yàn)組2料重比為1.386，對(duì)照組料重比為1.439，試驗(yàn)組1比對(duì)照組料重比降低6.05%，試驗(yàn)組2比對(duì)照組料重比降低3.68%，兩個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組間差異顯著；且試驗(yàn)組試驗(yàn)過(guò)程中保育豬腹瀉指數(shù)比對(duì)照組低，試驗(yàn)組1成活率為100%，試驗(yàn)組2成活率為98.33%（因病淘汰1頭），對(duì)照組成活率為96.67%（因病淘汰2頭）。綜上可知，添加0.2%和0.5%枯草芽孢菌BS18腐植酸鈉型菌粉對(duì)保育豬生長(zhǎng)性能有幫助，添加0.2%試驗(yàn)組數(shù)值上優(yōu)于添加0.5%試驗(yàn)組，但兩組間無(wú)明顯差異。

2.2 枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉對(duì)小豬生長(zhǎng)性能的影響

將枯草芽孢桿菌腐植酸鈉型菌粉，在小豬階段日糧中按照0.2%和0.5%進(jìn)行添加，經(jīng)過(guò)35天的喂養(yǎng)試驗(yàn)，其對(duì)小豬生長(zhǎng)性能的影響結(jié)果如表2所示。

表2 枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉對(duì)小豬生長(zhǎng)性能的影響Tab.2 Effects of sodium humate-type Bacillus subtilis BS18 on piglets growth performance

通過(guò)表2可知：試驗(yàn)組1平均每頭日增重0.635 kg，試驗(yàn)組2平均每頭日增重0.643 kg，對(duì)照組平均每頭日增重0.608 kg，試驗(yàn)組1比對(duì)照組平均每頭日增重提高4.44%，試驗(yàn)組2比對(duì)照組平均每頭日增重提高5.76%，兩個(gè)試驗(yàn)組間差異不顯著，但是兩個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組間差異極顯著；試驗(yàn)組1料重比為1.920，試驗(yàn)組2料重比為1.880，對(duì)照組料重比為2.000，試驗(yàn)組1比對(duì)照組料重比降低4.00%，試驗(yàn)組2比對(duì)照組料重比降低6.00%；試驗(yàn)組1與對(duì)照組間差異顯著，與試驗(yàn)組2間差異不顯著；且試驗(yàn)組試驗(yàn)過(guò)程中小豬腹瀉指數(shù)比對(duì)照組低，試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2成活率為100%，對(duì)照組試驗(yàn)過(guò)程中因病淘汰1頭，經(jīng)計(jì)算成活率為98.33%。綜上可知，添加0.2%和0.5%枯草芽孢桿菌腐植酸鈉菌粉對(duì)小豬生長(zhǎng)性能有幫助，添加0.5%試驗(yàn)組數(shù)值上優(yōu)于添加0.2%試驗(yàn)組，但兩組間無(wú)明顯差異。

2.3 枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉對(duì)中豬生長(zhǎng)性能的影響

將枯草芽孢桿菌腐植酸鈉型菌粉，在中豬階段日糧中按照0.2%和0.5%進(jìn)行添加，經(jīng)過(guò)35天的喂養(yǎng)試驗(yàn)，其對(duì)中豬生長(zhǎng)性能的影響結(jié)果如表3所示。

通過(guò)表3可知：試驗(yàn)組1平均每頭日增重0.810 kg，試驗(yàn)組2平均每頭日增重0.830 kg，對(duì)照組平均每頭日增重0.783 kg，試驗(yàn)組1比對(duì)照組平均每頭日增重提高3.45%，試驗(yàn)組2比對(duì)照組平均每頭日增重提高6.00%，兩個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組間差異顯著；試驗(yàn)組1料重比為2.740，試驗(yàn)組2料重比為2.660，對(duì)照組料重比為2.810，試驗(yàn)組1比對(duì)照組料重比降低2.49%，試驗(yàn)組2比對(duì)照組料重比降低5.34%，兩個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組間差異不顯著；試驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有腹瀉發(fā)生，成活率100%。綜上可知，添加0.2%和0.5%枯草芽孢菌BS18腐植酸鈉型菌粉對(duì)中豬生長(zhǎng)性能有幫助，添加0.5%試驗(yàn)組數(shù)值 上優(yōu)于添加0.2%試驗(yàn)組，但兩組間無(wú)明顯差異。

表3 枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉對(duì)中豬生長(zhǎng)性能的影響Tab.3 Effects of sodium humate-type Bacillus subtilis BS18 on middle pigs growth performance

2.4 枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉對(duì)育肥豬生長(zhǎng)性能的影響

將枯草芽孢桿菌腐植酸鈉型菌粉，在育肥豬階段日糧中按照0.2%和0.5%進(jìn)行添加，經(jīng)過(guò)35天的喂養(yǎng)試驗(yàn)，其對(duì)育肥豬生長(zhǎng)性能的影響結(jié)果如表4所示。

通過(guò)表4可知：試驗(yàn)組1平均每頭日增重1.010 kg，試驗(yàn)組2平均每頭日增重1.026 kg，對(duì)照組平均每頭日增重0.950 kg，試驗(yàn)組1比對(duì)照組平均每頭日增重提高6.32%，試驗(yàn)組2比對(duì)照組平均每頭日增重提高8.00%，兩個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組間差異顯著；試驗(yàn)組1料重比為3.164，試驗(yàn)組2料重比為3.130，對(duì)照組料重比為3.306，試驗(yàn)組1比對(duì)照組料重比降低4.49%，試驗(yàn)組2比對(duì)照組料重比降低5.32%，但兩個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組間差異不顯著；試驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有腹瀉發(fā)生，成活率均為100%。綜上可知，添加0.2%和0.5%枯草芽孢菌BS18腐植酸鈉型菌粉對(duì)育肥豬生長(zhǎng)性能有幫助，添加0.5%試驗(yàn)組數(shù)值上優(yōu)于添加0.2%試驗(yàn)組，但兩組間無(wú)明顯差異。

3 結(jié)論與討論

（1）枯草芽孢桿菌和腐植酸鈉作為生態(tài)型微生物制劑和營(yíng)養(yǎng)型生物飼料添加劑，通過(guò)在豬養(yǎng)殖上的試驗(yàn)結(jié)果表明：該菌粉生物性能安全可靠，能使保育豬平均每頭日增重提高6.19%～9.73%、料重比下降3.68%～6.05%、成活率提高1.66%～3.33%、腹瀉指數(shù)下降4.36～4.37；能使小豬平均每頭日增重提高4.44%～5.76%、料重比下降4.00%～6.00%、成活率提高1.67%、腹瀉指數(shù)下降3.34～3.87；能使中豬平均每頭日增重提高3.45%～6.00%、料重比下降2.49%～5.34%；能使育肥豬平均每頭日重提高6.32%～8.00%、料重比下降4.49%～5.32%；枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉在保育豬、小豬、中豬和育肥豬階段應(yīng)用均有不同程度的提高生長(zhǎng)性能的功效，而且飼喂該菌粉后豬糞便松軟、顏色淺黑色、臭味減輕，養(yǎng)殖環(huán)境明顯改善。

（2）枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉在保育豬階段的最佳添加量為0.2%；小豬、中豬和育肥豬階段的最佳添加量為0.5%。從豬生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程來(lái)看，保育豬生長(zhǎng)發(fā)育還未完成，從吃 母乳的液體飼料到吃人工配制的固體日糧，胃腸粘膜損傷較嚴(yán)重，所以腹瀉較多。腐植酸鈉具有表面活性劑的作用，能吸附有毒有害物質(zhì)，起到收斂、止血、止瀉作用，同時(shí)枯草芽孢桿菌屬于耗氧型有益菌，進(jìn)入腸道后通過(guò)呼吸耗氧，與腐敗菌爭(zhēng)氧，造成腸道厭氧環(huán)境，改善腸道內(nèi)微生物菌群比例，使厭氧型乳酸菌增加，從而減少腸道有害菌的生存環(huán)境。因此，腐植酸鈉與枯草芽孢桿菌的結(jié)合，起到了1+1≥2的效果。保育豬胃腸發(fā)育不完全，過(guò)多添加該菌粉，不能完全消化吸收，所以未能表現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)性能，因此添加0.2%菌粉效果優(yōu)于添加0.5%。小豬、中豬和肥育豬的消化系統(tǒng)發(fā)育成熟，對(duì)菌粉的消化吸收利用更完全，所以表現(xiàn)出添加0.5%菌粉效果更佳。

綜上可知，枯草芽孢桿菌BS18腐植酸鈉型菌粉在保育豬、小豬、中豬和育肥豬階段均有提高生長(zhǎng)性能的功效，尤其在保育豬階段應(yīng)用效果更佳?？莶菅挎邨U菌BS18腐植酸鈉型菌粉在豬養(yǎng)殖中具有廣闊的應(yīng)用前景。