耿正穎，史林鑫，劉 萍，陸文清

(中國農業(yè)大學動物科技學院 動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

抗生素作為治療細菌感染性疾病的主要藥物，在畜牧養(yǎng)殖生產上做出了巨大的貢獻，然而，抗生素大規(guī)模、高劑量的使用也產生了諸多安全性問題，例如畜禽內源性感染和二重感染，耐藥性菌株的產生和動物機體免疫力下降。歐盟于2006年1月1日起已全面禁止畜牧行業(yè)中抗生素生長促進劑的使用，我國對抗生素使用的要求也日益嚴格。

對仔豬而言，由于其腸道發(fā)育還不健全,皮下脂肪少,體溫調節(jié)能力差，代謝機能旺盛，極易受到營養(yǎng)及外部環(huán)境等諸多因素的影響，產生以腹瀉、生長停滯等為標志的“仔豬早期斷奶綜合征”。而斷奶應激還會導致仔豬腸道菌群的紊亂，乳酸菌等有益菌數量的減少，大腸桿菌等病原菌數量的上升，因此如何在限用甚至禁用抗生素后維持斷奶仔豬腸道穩(wěn)態(tài)，提高斷奶仔豬的免疫功能和抗應激能力成為目前重要研究課題。

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)又名酪酸菌，是我國農業(yè)部于2009年7月批準的新一代微生物飼料添加劑。研究報道，丁酸梭菌能改善動物腸道微生態(tài)環(huán)境，增強機體免疫功能，尤其對治療由腸道菌群紊亂引起的炎癥、急慢性腹瀉、腸應激綜合征等疾病效果顯著[1-3]。其主要代謝產物丁酸被認為是大腸上皮細胞的主要供能物質[4]，在維持動物腸道健康和機體能量代謝過程中發(fā)揮重要作用[5-12]，但目前關于丁酸梭菌對斷奶仔豬生長性能、抗氧化能力、免疫功能影響的報道較少。因此，本試驗通過在仔豬日糧中添加不同濃度的丁酸梭菌來探討其對斷奶仔豬生長性能、抗氧化能力和免疫功能的影響，為丁酸梭菌在動物生產中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

丁酸梭菌制劑由浙江惠嘉生物科技有限公司提供，有效活菌數為5×109CFU·g-1。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

選用180頭初始體重為(8.07±0.84)kg的杜× 長×大三元雜交仔豬，公母各半，按照完全隨機區(qū)組分為5組，每組6個重復，每個重復6頭豬。試驗分為陰性對照組，飼喂不含抗生素的基礎日糧；抗生素組，在基礎日糧中添加75 mg·kg-1金霉素；丁酸梭菌組，分別在基礎日糧中添加0.02‰、0.02%、0.1%的丁酸梭菌制劑，使得日糧中丁酸梭菌有效活菌數分別為1.0×108CFU·kg-1、1.0×109CFU·kg-1、5.0×109CFU·kg-1。日糧參考NRC(2012)[13]和中國飼料成分與營養(yǎng)價值進行配制，其基礎日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗仔豬分欄飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于1.5 m×2.1 m的圈內，漏縫噴塑地板，不銹鋼可調式料槽，乳頭式飲水器。粉料飼喂，自由采食和飲水。

表1 基礎日糧組成和營養(yǎng)水平

1).預混料為每千克飼料提供：維生素A 15 000 IU；維生素D38 000 IU；維生素E 30 IU；維生素K32.5 mg；維生素 B12.5 mg； 維生素 B24.0 mg；維生素B63.0 mg；維生素B1220 μg； 尼克酸40 mg；泛酸 112.5 mg；葉酸0.7 mg；生物素20 μg； 鐵400 mg；銅150 mg；鋅150 mg；錳80 mg；碘0.4 mg；硒0.3 mg。2).消化能為計算值，其余為實測值

1).Premix provide the following per kilogram of diet: 15 000 IU vitamin A as vitamin A acetate, 8 000 IU vitamin D as vitamin D3, 30 IU vitamin E as DL-α-tocophethenate, 2.5 mg vitamin K as vitamin K3, 2.5 mg vitamin B1, 4.0 mg vitamin B2, 3.0 mg vitamin B6, 20 μg vitamin B12, 40 mg nicotinic acid, 112.5 mg pantothenic acid, 0.7 mg folic acid, 20 μg biotin, 400 mg Fe as ferrous sulfate, 150 mg Cu as basic cupric chloride, 150 mg Zn as zinc sulfate, 80 mg Mn as manganese sulfate, 0.4 mg I as ethylenediamine dihydroiodide and 0.3 mg Se as sodium selenite.2).DE is calculated values, others are measured values

1.3 生長性能測定

試驗開始后第 0、14 和 28天早晨對每頭仔豬進行逐一稱重，數據用于計算平均日增重(average daily gain，ADG)；以重復(圈)為單位記錄耗料量，試驗第14、28 天結料稱重，數據用于計算平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)；以重復(圈)為單位，計算 ADFI 與 ADG 比值，結果表示為飼料轉化率(feed conversion ratio，FCR)。每圈具體的計算公式：

平均日增重(g)=(平均末重-平均初始重)/ 天數；

平均日采食量(g)=(總投料量-剩料量)/(天數×當圈頭數)；

飼料轉化率=平均日采食量/平均日增重。

1.4 腹瀉率測定

從試驗期開始，每天早晨8:00 點，下午15:00點，觀察仔豬的腹瀉狀況，及時記錄。仔豬是否腹瀉主要以觀察動物個體行為狀態(tài)(如，尾部沾染濕糞便、拉稀、肛門紅腫和脫水等外在表征)與圈舍漏糞板上的稀便痕跡為主。具體計算公式：

每圈腹瀉率(%)=∑(腹瀉仔豬數×腹瀉天數)/(圈總豬數×總天數)。

1.5 糞便評分

試驗期間，為了判斷奶仔豬腹瀉的嚴重程度，每天進行糞便評分。糞便評分標準參照 Pierce等[14]所使用的方法，即：1=硬便；2=輕微軟便；3=部分成型的軟便；4=松散，半液體的糞便；5=水樣黏液型糞便。

1.6 血清免疫功能和抗氧化能力的測定

試驗第28天早晨從每個重復中各選1頭健康、體重接近平均水平的仔豬進行前腔靜脈采血5～7 mL， 室溫靜置2 h，4 ℃下3 000 r·min-1離心15 min，取上清液分裝于1.5 mL Eppendorf管中，置于-20 ℃低溫冰箱中保存。依照相應商品試劑盒(北京華英生物技術研究所，北京，中國)的說明測定血清中免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、腫瘤壞死因子-α、白介素-1β、白介素-4、白介素-6、超氧化物歧化酶活性、總抗氧化能力、谷胱甘肽過氧化物酶活性和丙二醛的含量。

1.7 數據分析

數據采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并且對不同丁酸梭菌添加量的3組結果進行線性和二次模型的分析。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 丁酸梭菌對斷奶仔豬生長性能的影響

如表2所示，本試驗中各處理組豬的生長性能均較好，平均日增重約430 g。1～14 d、15～28 d以及1～28 d日糧中添加不同濃度的丁酸梭菌對斷奶仔豬平均日增重、平均日采食量和耗料增重比均無顯著影響(P>0.05)。

2.2 日糧添加丁酸梭菌對斷奶仔豬腹瀉率的影響

如表3所示，各處理之間斷奶仔豬的腹瀉率差異不顯著(P>0.05)。1～14 d和1～28 d不同添加劑量丁酸梭菌處理組的腹瀉率隨添加劑量的上升呈線性顯著增加(P<0.05)。15～28 d和1～28 d各處理之間斷奶仔豬糞便評分差異顯著(P<0.05)。

2.3 丁酸梭菌對斷奶仔豬血清抗氧化指標的影響

丁酸梭菌對斷奶仔豬血清抗氧化特征指標的影響如表4所示。與基礎日糧組相比，日糧中添加5.0×109CFU·kg-1的丁酸梭菌可以顯著提高斷奶仔豬血清中谷胱甘肽過氧化物酶的含量和總抗氧化能力(P<0.05)，達到和抗生素組相近的水平。與基礎日糧組相比，日糧中添加1×109CFU·kg-1和5.0×109CFU·kg-1的丁酸梭菌均顯著提高斷奶仔豬血清中總超氧化物歧化酶的含量(P<0.05)；并且斷奶仔豬血清中的總超氧化物歧化酶水平隨丁酸梭菌添加量的增加呈線性顯著提高(P<0.05)。相比于基礎日糧組，丁酸梭菌處理組斷奶仔豬血清中MDA的含量無顯著變化(P>0.05)。

2.4 丁酸梭菌對斷奶仔豬血清免疫指標的影響

如表5所示，各處理組隨著丁酸梭菌添加量的增加仔豬血清IgG的含量有上升的趨勢(P<0.10)。與基礎日糧組相比，日糧中添加5.0×109CFU·kg-1的丁酸梭菌可以顯著降低仔豬血清中TNF-α(P<0.05)和IL-6(P<0.01)的含量，顯著提高血清中IL-4含量(P<0.01)，并且斷奶仔豬血清中的IL-4含量隨丁酸梭菌添加量的增加呈線性顯著提高(P<0.05)。各處理組仔豬血清中白細胞介素-1β含量無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 丁酸梭菌對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響

目前，丁酸梭菌對動物生長性能和腹瀉率的影響已有一些報道。王保正等[15]報道，在哺乳仔豬飼料中添加丁酸梭菌，可顯著提高仔豬斷奶時料重比，提高育成率及斷奶后的生長性能。Liao等[1]研究表明，添加不同劑量的丁酸梭菌能顯著提高1～21日齡肉雞的平均日增重，達到抗生素組水平。Zhao等[16]發(fā)現，飼料中添加丁酸梭菌不僅可以顯著提高肉雞平均日增重和平均日采食量，還可加速肉雞脂肪沉積。然而，Zhang等[17]、Amerah等[18]報道，日糧中添加丁酸梭菌制劑對動物生長性能的提高無顯著影響。

在本試驗中，1～14 d，與基礎日糧組相比，日糧中添加1.0×108CFU·kg-1、1.0×109CFU·kg-1和5.0×109CFU·kg-1丁酸梭菌的試驗組，其平均日增重分別提高了3.8%、4.0%和 6.6%；15～28 d， 各組平均日增重沒有明顯差異，但采用丁酸梭菌替代抗生素后，可以減輕仔豬肝代謝抗生素的負擔，有利于仔豬后期生長優(yōu)勢的體現。

仔豬斷奶時腸道形態(tài)結構尚不完整，腸道細胞分殖、成熟程度尚不完善，因此，仔豬對飼料的消化和營養(yǎng)的吸收過程中容易產生生理性或病理性的障礙。而丁酸梭菌在動物腸道內產生對宿主健康具有重要生理意義的多種代謝產物，包括蛋白酶、淀粉酶、乙酸、丁酸等[19-21]。且丁酸是腸道上皮細胞首選能源底物，對維持動物腸道結構的完整性和促進腸道細胞增殖與成熟起到重要的作用[22]。丁酸還可以促進胰腺分泌、增強空腸刷狀緣酶活性，刺激胰高血糖素樣肽-2的生成，從而提高腸道對營養(yǎng)物質的消化吸收[23-24]。在試驗后期，斷奶仔豬腸道形態(tài)結構已發(fā)育成型，腸道微生物群落已定植完全并穩(wěn)定，因此，丁酸梭菌的添加對其生長性能無明顯影響。

3.2 日糧添加丁酸梭菌對斷奶仔豬腹瀉率的影響

胡遠亮[25]發(fā)現，在斷奶仔豬日糧中添加0.5×108～ 5.0×108CFU·kg-1丁酸梭菌可顯著降低其腹瀉率。在本試驗中，日糧中添加1.0×108CFU·kg-1丁酸梭菌與陰性對照組相比，腹瀉率在1～14 d、15～28 d分別下降了45%、54%；在1～14 d、1～28 d仔豬腹瀉率隨著丁酸梭菌添加量的增加呈線性顯著上升。分析原因可能是試驗早期斷奶仔豬腸道微生物群落尚未穩(wěn)定，菌群種類和豐度均處于不斷演化的過程，大量攝入外源性丁酸梭菌對其腸道原有微生物群落產生沖擊，從而引發(fā)仔豬腹瀉率顯著上升。而在試驗后期，15～28 d，仔豬腸道微生物群落已穩(wěn)定，因此腹瀉率下降，且各處理差異不顯著。

3.3 丁酸梭菌對斷奶仔豬血清抗氧化能力的影響

正常生理狀態(tài)下，動物體內自由基的生成和抗氧化防御系統(tǒng)處于動態(tài)平衡中，當動物處于病理或應激狀態(tài)時，機體會大量產生羥基自由基等對機體有害的氧化物。谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物酶在機體清理過氧化物，減少羥基自由基形成的過程中發(fā)揮重要作用。血清中總抗氧化能力是衡量機體抗氧化能力的綜合指標，丙二醛含量的高低顯示了機體中自由基介導的脂質過氧化程度。目前已有研究報道，丁酸梭菌不僅可以代謝產生丁酸和氫氣，更會產生超氧化物歧化酶、還原型輔酶Ⅰ、Ⅱ過氧化物酶，幫助機體清除羥自由基和活性氧，起到抗氧化的作用[26-29]。

賈聰慧等[30]報道，日糧添加丁酸梭菌可顯著增強肉雞血清中谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，且隨日齡增加，丁酸梭菌的促進作用比抗生素更加明顯和穩(wěn)定。Liao等[1]研究表明，添加丁酸梭菌對21日齡肉雞血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活力沒有顯著影響，但顯著增加了還原型谷胱甘肽、谷胱甘肽S-轉移酶的活性。

本試驗中，與基礎日糧組相比，日糧添加5.0×109CFU·kg-1丁酸梭菌試驗組顯著提高了斷奶仔豬血清中谷胱甘肽過氧化物酶的含量和總抗氧化能力。日糧添加1.0×109CFU·kg-1和5.0×109CFU·kg-1丁酸梭菌可顯著增加斷奶仔豬血清中超氧化物歧化酶的含量，并且超氧化物歧化酶的含量隨丁酸梭菌添加量的增加呈線性顯著上升。

3.4 丁酸梭菌對斷奶仔豬血清免疫指標的影響

免疫球蛋白是動物機體內免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其中IgG是免疫球蛋白的主要成分，約占血清中免疫球蛋白總濃度的75%[31]。本試驗中，仔豬飼喂添加丁酸梭菌的日糧后，其血清IgG的含量有上升的趨勢，而血清中IgA、IgM的含量未發(fā)生顯著變化。Yang 等[32]研究表明，日糧添加2×107CFU·kg-1和3×107CFU·kg-1的丁酸梭菌能顯著提高14～42日 齡嶺南黃羽肉雞血清中IgA、IgG的含量；并且血清中IgM含量也在21～42日齡時顯著升高。賈聰慧等[30]研究發(fā)現，添加丁酸梭菌顯著提高了肉雞血清中IgA、IgG、IgM的含量，其中IgG含量的提高比例最高。

TNF-α是機體中一種重要的細胞因子，在表達黏附分子、成纖維增殖因子、凝血因子以及啟動細胞毒性、凋亡和急性期反應等過程中發(fā)揮作用。IL-6是一種免疫調節(jié)細胞因子，在炎癥反應中啟動了細胞表面信號復合體發(fā)揮作用。IL-4是一種抗炎因子，通過刺激B細胞和T細胞發(fā)揮免疫抑制效應。另外，李玉鵬等[33]發(fā)現，日糧中丁酸梭菌的添加，降低了斷奶仔豬血清中IL-1β的含量，提高了IL-10的含量。高權新[34]試驗表明，丁酸梭菌顯著提高了IL-10 和熱休克蛋白70的表達量，進而增強了腸道黏膜的免疫耐受力。在本試驗中，與基礎日糧組相比，日糧中添加5.0×109CFU·kg-1的丁酸梭菌可以顯著降低仔豬血清中TNF-α和IL-6含量(P<0.05)， 顯著提高血清中IL-4含量(P<0.05)，并且斷奶仔豬血清IL-4含量隨丁酸梭菌添加量的增加呈線性顯著增加(P<0.05)，結果表明，日糧中添加5.0×109CFU·kg-1丁酸梭菌可以有效的增強仔豬機體的免疫力，從而降低炎癥的發(fā)生。

4 結 論

本試驗結果表明，日糧中添加1×109～ 5.0×109CFU·kg-1丁酸梭菌可以提高斷奶仔豬抗氧化能力和免疫功能，有助于提高仔豬斷奶階段的健康水平和抗應激能力。