黃麗英，鄒 圓，陸 強(qiáng)，范棟杰，顧 捷，龍 舉，張?jiān)滦?*

孕激素是一類(lèi)由卵巢黃體細(xì)胞分泌維持妊娠所必需的的二十一碳類(lèi)固醇激素，主要以孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮等為主，長(zhǎng)時(shí)間食用含有孕激素的食品可能產(chǎn)生惡心、頭痛、月經(jīng)紊亂、卵巢腫大等問(wèn)題[1]。禽蛋又名禽卵，是家禽所產(chǎn)的卵，富含卵磷脂、固醇類(lèi)、多不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的方便膳食補(bǔ)充來(lái)源[2-3]。禽蛋類(lèi)食物本身含有內(nèi)源性孕酮，其食用健康安全性尤其對(duì)兒童發(fā)育的影響備受關(guān)注，但鮮見(jiàn)有相關(guān)研究資料表明禽蛋天然內(nèi)源性孕酮與食品安全有關(guān)，同時(shí)飼養(yǎng)過(guò)程中使用外源性激素（如醋酸美倫孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮）對(duì)禽蛋中內(nèi)源性激素含量變化的影響也不明晰，而且禽蛋中相關(guān)的國(guó)家食品標(biāo)準(zhǔn)亦沒(méi)有對(duì)孕激素進(jìn)行限量的規(guī)定[4]。因此有必要建立準(zhǔn)確、高效的禽蛋中孕激素的檢測(cè)方法，利于掌握和分析禽蛋中內(nèi)外源性孕激素含量，為開(kāi)展禽蛋中孕激素的安全性評(píng)價(jià)提供可靠的分析測(cè)定依據(jù)，對(duì)保障農(nóng)產(chǎn)品安全具有現(xiàn)實(shí)意義。

目前激素的檢測(cè)多集中在β激動(dòng)劑[5]、糖皮質(zhì)激素[6]方面，而且主要在環(huán)境水體[7-8]、化妝品[9]、生物樣品[10-11]方面，其中最常用的方法為液相色譜法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜法[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]等，其中液相色譜法抗干擾能力較弱，氣相色譜-質(zhì)譜法需要衍生化，大多應(yīng)用于環(huán)境中的雌激素檢測(cè)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有定性能力強(qiáng)、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛地應(yīng)用于食品領(lǐng)域。Yang Yi[15]、Wang Quanlin[16]等建立了禽蛋中性激素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，但禽蛋中4 種孕激素同時(shí)測(cè)定的方法鮮見(jiàn)報(bào)道。國(guó)家也陸續(xù)發(fā)布了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[17]，GB/T 21981—2008《動(dòng)物源食品中激素多殘留檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》對(duì)動(dòng)物源性食品中的激素進(jìn)行多殘留檢測(cè)，因該標(biāo)準(zhǔn)是在特定背景下推出，標(biāo)準(zhǔn)推出時(shí)間倉(cāng)促，涉及范圍太廣，采用雙柱聯(lián)合的方式回收率不甚理想[18-19]。分散固相萃取技術(shù)是在提取液中直接加入吸附劑粉末進(jìn)行凈化，由Lehotay[20]和Anastassiades[21]提出的一種快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高效、可靠和安全的前處理技術(shù)QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe），最早在農(nóng)藥多殘留中使用，近年來(lái)已越來(lái)越多的應(yīng)用于藥物殘留檢測(cè)[22-28]。先進(jìn)的QuEChERS樣品預(yù)處理技術(shù)目前也逐漸應(yīng)用于禽蛋中各種硝基咪唑類(lèi)、氯霉素等抗生素檢測(cè)[29-30]。本實(shí)驗(yàn)采用分散固相萃取進(jìn)行樣品凈化，運(yùn)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術(shù)，建立了禽蛋中4 種孕激素同時(shí)檢測(cè)的方法。實(shí)驗(yàn)使用正己烷提取，成功解決了蛋白質(zhì)變性結(jié)塊從而包裹目標(biāo)物的問(wèn)題，同時(shí)借鑒國(guó)際上通用的分散固相萃取技術(shù)在凈化過(guò)程中利用N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）固相吸附劑有效除去了蛋黃素、卵磷脂等后期氮吹對(duì)目標(biāo)物回收率產(chǎn)生影響的物質(zhì)，極大提高了回收率，拓展了分散固相萃取技術(shù)在禽蛋中激素檢測(cè)領(lǐng)域的新應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、正已烷（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；甲酸（色譜純） 美國(guó)Tedia公司；C18和弗羅里硅土上海安譜科學(xué)儀器有限公司；PSA 美國(guó)Sigma公司。

雌性激素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：孕酮、醋酸美倫孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；同位素：孕酮-D9內(nèi)標(biāo) 加拿大C/D/N ISOTOPES公司。

分別稱(chēng)取10 mg各標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1 mg/mL的儲(chǔ)備液，并密封貯存于-20 ℃冰箱中。使用時(shí)用流動(dòng)相或基質(zhì)提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測(cè)。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITYTMUPLC儀、XEVO TQ-MS MS/MS儀 美國(guó)Waters公司；WH-861渦旋混合器 太倉(cāng)華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZHWY-110X往復(fù)式恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智城分析儀器制作有限公司；HGC-36A氮吹儀天津市恒奧科技有限公司；BIOFUGE STRATOS高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 儀器條件

為獲取較高靈敏度，采用注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式對(duì)4 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和1 種內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)包括檢測(cè)離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量等進(jìn)行自動(dòng)調(diào)諧優(yōu)化。其他質(zhì)譜條件：孕激素采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）正離子模式；毛細(xì)管電壓：3.0 kV（＋）；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h；碰撞池壓力：3.0×10-3mbar。

1.3.2 色譜條件

采用ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）分離。柱溫為35 ℃，樣品溫度為25 ℃，進(jìn)樣體積為5 μL，流速為0.2 mL/min。根據(jù)激素的化學(xué)性質(zhì)，選擇甲醇-水、乙腈-水和甲醇-0.1%甲酸溶液3 種不同流動(dòng)相對(duì)色譜峰的峰形以及分離效果進(jìn)行優(yōu)化。最終選取流動(dòng)相A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇。梯度洗脫：0～1.5 min，30% B；1.5～4.0 min，30%～80% B；4.0～5.0 min，80% B；5.0～5.5 min，80%～30% B；5.5～8.0 min，30% B。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 提取

將新鮮禽蛋打碎攪拌均勻后稱(chēng)取樣品2.0 g于50 mL具塞塑料離心管中，加入10 mL正己烷，渦旋3 min，振搖10 min，在4 ℃、10 000 r/min離心10 min后，取上清液至玻璃管中。再用10 mL的正己烷重復(fù)提取一次，合并上層有機(jī)液，在45 ℃氮?dú)獯蹈?，待凈化。在提取條件優(yōu)化的過(guò)程中，主要對(duì)乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇和正己烷5 種提取溶劑，振蕩提取法、均質(zhì)提取法以及超聲提取法3 種提取方式的提取效率進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)比較。

1.3.3.2 凈化

加入1 mL的甲醇-水（1∶1，V/V）復(fù)溶殘?jiān)?，倒入裝有50 mg PSA的2 mL高速離心管中，振搖10 min，放入冰箱－20 ℃冷凍靜置10 min后，以14 000 r/min離心10 min，取澄清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。在凈化條件優(yōu)化的過(guò)程中，考察弗羅里硅土、PSA和C18不同吸附劑種類(lèi)和用量對(duì)凈化目標(biāo)化合物的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用注射泵連續(xù)進(jìn)樣進(jìn)行孕激素的分析，孕酮、醋酸美倫孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和孕酮-D9共5 種標(biāo)準(zhǔn)品采用ESI＋離子化模式，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行全掃描，對(duì)毛細(xì)管電壓、錐孔電壓進(jìn)行充分的優(yōu)化，確定準(zhǔn)分子離子峰。再使用子離子掃描方式，調(diào)節(jié)碰撞能量，分別選取經(jīng)碰撞后所得豐度較高、碎片結(jié)構(gòu)合理的兩個(gè)子離子作為定量和定性離子，并優(yōu)化其最佳碰撞能量。最終確定的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分別選擇甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相同時(shí)分析4 種孕激素的分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈-水并不能使這4 種離子完成出峰，而甲醇-水可以使醋酸甲地孕酮、醋酸美倫孕酮、醋酸氯地孕酮、孕酮4 種孕激素分離出峰，但4 種孕激素則峰形很差。為了提高孕激素化合物的離子化效率，在水相中加入0.1%甲酸，各激素的峰形和靈敏度有了較大改善。因此分別采用甲醇-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相分析4 種孕激素，圖1為ESI＋離子化模式下4 種孕激素標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖。

圖1 ESI+離子化模式下4 種孕激素標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of standard solutions of progesterone hormones under ESI+ mode

2.3 前處理技術(shù)的優(yōu)化

2.3.1 提取方式的選擇

實(shí)驗(yàn)對(duì)振蕩提取法、均質(zhì)提取法以及超聲提取法在提取禽蛋中孕激素的效果進(jìn)行了比較。選取3 組樣品，每組加入相同的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液后加入等量的提取溶劑，第1組采取振蕩提取法，時(shí)間10 min；第2組采用均質(zhì)提取法，時(shí)間10 min；第3組采用超聲波提取法，時(shí)間10 min。其他處理步驟如1.3節(jié)，結(jié)果如表2所示。

表2 3 種不同提取方式的回收率比較Table 2 Comparison of recoveries of three different extraction methods

從表2可以看出，振蕩提取效果最好，其次是均質(zhì)提取，最差的為超聲提取。這可能是禽蛋樣品蛋白質(zhì)含量比較高，樣品比較黏稠，聲波空化作用導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)分散，加大了對(duì)目標(biāo)化合物的包裹，所以選取振蕩提取方式作為本實(shí)驗(yàn)樣品的提取方式。

2.3.2 提取液的選擇

孕激素類(lèi)化合物的極性一般表現(xiàn)為較弱或者中等，提取溶劑常用的有乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇、正己烷等。實(shí)驗(yàn)分別選取了乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇、正己烷作為提取溶劑進(jìn)行比較，效果見(jiàn)圖2?？紤]到禽蛋中含有大量的卵磷脂和腦磷脂，直接用乙酸乙酯和叔丁基甲醚提取，提取液中會(huì)形成較多的白色稠狀物，影響凈化結(jié)果。結(jié)合振蕩提取方式，考察乙腈、甲醇等不同提取溶劑的提取效率，發(fā)現(xiàn)使用乙腈與甲醇提取立刻使蛋白質(zhì)變性，形成大的顆粒狀物質(zhì)，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行包裹，極大地降低了回收率，并且禽蛋中的蛋黃素會(huì)被乙腈和甲醇提取出，氮吹時(shí)這些蛋黃素等物質(zhì)也會(huì)把目標(biāo)物包裹。使用正己烷提取，禽蛋中的蛋白質(zhì)在正己烷中并不結(jié)塊，且呈現(xiàn)分散狀，故很好地解決因蛋白質(zhì)變性對(duì)目標(biāo)物包裹問(wèn)題，其次實(shí)驗(yàn)用正己烷提取，可以省去無(wú)水硫酸鎂除水步驟，既節(jié)省了時(shí)間又減少了吸附性損失。

圖2 不同提取溶劑對(duì)4 種孕激素提取效率的影響Fig. 2 Effects of different solvents on the extraction efficiency of 4 progesterone hormones

2.3.3 分散固相萃取條件的選擇與優(yōu)化

2.3.3.1 吸附劑種類(lèi)的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用分散固相萃取進(jìn)行凈化，分別對(duì)弗羅里硅土、PSA和C18進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，弗羅里硅土是一種強(qiáng)極性吸附劑，對(duì)基質(zhì)液中的脂類(lèi)、糖類(lèi)沒(méi)有凈化作用；PSA和C18能除去基質(zhì)中的脂肪酸和糖類(lèi)物質(zhì)，但同時(shí)C18對(duì)孕激素吸附比較大，導(dǎo)致提取率下降，而PSA對(duì)孕激素吸附作用小，故選擇PSA作為吸附劑，見(jiàn)圖3。

圖3 分散劑對(duì)4 種孕激素的吸附能力Fig. 3 Adsorption capacity of dispersant toward 4 progesterone hormones

2.3.3.2 吸附劑用量的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察30、40、50、60、70、80、90 mg等不同質(zhì)量的PSA對(duì)4 種孕激素的凈化效果，如圖4所示。當(dāng)PSA為30 mg時(shí)，4 種孕激素的回收率為107.3%～140.1%，這一方面可能是禽蛋中自帶的孕激素對(duì)回收率的影響，另一方面可能是禽蛋樣品中未被除去基質(zhì)干擾物對(duì)目標(biāo)分子具有基質(zhì)增強(qiáng)作用。當(dāng)PSA含量為50～60 mg時(shí)，除孕酮外的3種孕激素的回收率為92.8%～99.0%。當(dāng)PSA的用量進(jìn)一步增加時(shí)，致使回收率降低，可能是PSA中的—NH2與孕激素的羰基發(fā)生氫鍵作用的幾率增加。綜上所述，選擇吸附劑用量為50 mg。

圖4 不同質(zhì)量的PSA對(duì)4 種孕激素的凈化效果Fig. 4 Purification efficiency of different amounts of PSA for 4 progesterone hormones

2.3.3.3 富集后處理的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)改變了一般QuEChERS方法的凈化步驟，改成氮吹定容后再凈化，一方面提高了PSA的利用率，避免了小質(zhì)量?jī)艋w粒對(duì)大體積試劑凈化效果不佳的影響，另一方面避開(kāi)了一般QuEChERS方法部分提取不均對(duì)濃度折算的誤差。此外，冷凍10 min后離心，能有效去除去小部分的油脂，達(dá)到低溫脫脂的效果。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限

用除含孕酮外的3 種孕激素含量均低于檢出限的禽蛋作為基質(zhì)樣品，經(jīng)前處理得到樣品基質(zhì)液，用基質(zhì)提取液配制醋酸美倫孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)化合物的峰面積（y）對(duì)其相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）分別繪制外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線。孕酮用流動(dòng)相配制0.4～100 μg/L范圍的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各點(diǎn)內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為10 μg/L，繪制內(nèi)標(biāo)法校準(zhǔn)曲線。4 種孕激素具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.996。根據(jù)3 倍信噪比確定檢出限，10 倍信噪比確定定量限，具體見(jiàn)表3。

表3 4 種孕激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, limits of detection,and limits of quantitation for 4 hormones

2.4.2 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別在已知孕酮含量的禽蛋樣品中添加3 種不同水平的4 種孕激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3節(jié)方法進(jìn)行預(yù)處理，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6 次，分別計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，具體見(jiàn)表4?？梢钥闯? 種加標(biāo)水平下，醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸美倫孕酮和孕酮4 種孕激素的回收率分別為85.7%～99.7%、86.4%～96.8%、85.3%～94.5%、79.5%～88.6%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.2%～9.5%、1.4%～4.5%、3.8%～5.7%、2.3%～4.7%，可以滿(mǎn)足日常樣品分析要求。

表4 禽蛋中4 種孕激素的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of 4 progesterone hormones in spiked egg (n = 6)

2.5 實(shí)際樣品分析和確證

對(duì)從超市、菜場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的36 批次禽蛋進(jìn)行測(cè)定，禽蛋試樣中MRM離子流色譜圖如圖5所示，孕酮處有明顯的色譜峰，應(yīng)為內(nèi)源性孕酮，孕酮的含量在5～65 μg/kg之間。為了驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性，用離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜通過(guò)多級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，對(duì)孕酮陽(yáng)性樣品進(jìn)行了確證。圖6為禽蛋中檢出的孕酮三級(jí)質(zhì)譜圖，與標(biāo)準(zhǔn)品的多級(jí)質(zhì)譜圖母離子（m/z 315.232 7）、二級(jí)子離子（m/z 297.220 0）以及三級(jí)子離子（m/z 203.434 0）的質(zhì)量數(shù)偏差分別為－3.9、－0.1、0.5 mDa，可以準(zhǔn)確地對(duì)該樣品進(jìn)行定性分析。

圖5 雞蛋樣品孕酮和孕酮內(nèi)標(biāo)提取離子流圖Fig. 5 Extracted ion chromatograms of egg samples and internal standard

圖6 雞蛋樣品中孕酮的三級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 6 Mass spectra of positive egg samples

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用分散固相萃取-UPLC-MS/MS技術(shù)建立了同時(shí)檢測(cè)禽蛋中4 種孕激素的分析方法，通過(guò)儀器條件、提取溶劑和方式、吸附劑種類(lèi)和用量方面的優(yōu)化考察，方法的檢出限為0.2 μg/kg，回收率在79.5%～99.7%之間，方法學(xué)評(píng)價(jià)表明該方法靈敏度高、回收率好。尤其使用正己烷作為提取溶劑并結(jié)合振蕩提取法，可避免禽蛋中蛋白質(zhì)變性對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行包裹的現(xiàn)象從而提升測(cè)定的回收率。同時(shí)在凈化過(guò)程中使用PSA吸附劑有效除去了禽蛋中蛋黃素、卵磷脂等后期氮吹對(duì)目標(biāo)物回收率產(chǎn)生影響的物質(zhì)，重復(fù)性好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。相比GB/T 21981—2008雙柱聯(lián)合凈化，該方法簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程，提高了凈化效率和凈化速度，縮短了分析時(shí)間。本方法還通過(guò)離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜多級(jí)質(zhì)譜分析功能，對(duì)孕酮陽(yáng)性樣品進(jìn)行了確證。優(yōu)化后正己烷提取、PSA凈化的UPLC-MS/MS測(cè)試方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)，其回收率及重復(fù)性能滿(mǎn)足日常檢測(cè)的要求。